ZONA GRIS: IMPORTANCIA DE LA FASE PREANALITICA EN BIOLOGÍA MOLECULAR.

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1 ZONA GRIS: IMPORTANCIA DE LA FASE PREANALITICA EN BIOLOGÍA MOLECULAR. Autores: Dª. Sonia Vidal Rico. D. Fernando Grossón García. D. Carlos Pascual Ferrer. Dª. Elena Vidal Rico. Dª. Concepción Tuset Ruiz. Consorcio Hospital General Universitario de Valencia. INTRODUCCIÓN El virus de la hepatitis C (VHC) afecta aproximadamente a 170 millones de personas en todo el mundo y se caracteriza por ser un virus extremadamente eficaz en producir enfermedad crónica y evadir la respuesta inmunológica del huésped. Está considerado como el responsable del 90-95% de los casos de hepatitis post transfusional no tipo A ni B. Al tratarse de un virus de transmisión hemática, se puede transmitir mediante sangre u otros hemoderivados, así como a través de material clínico contaminado. La evolución suele conducir a enfermedad hepática grave (esteatosis, cirrosis y hepatocarcinoma) que con frecuencia requiere transplante hepático, convirtiéndose este virus en un gran problema, no solo médico sino socioeconómico. La adopción generalizada de medidas de detección de anticuerpos anti-vhc en sangre ha disminuido de manera significativa el riesgo de transmisión asociada a la transfusión. La presencia de anticuerpos anti-vhc en pacientes infectados con este virus ha conducido al desarrollo de ensayos inmunoserológicos específicos para dichos anticuerpos. No obstante la presencia de dichos anticuerpos es una medida de la exposición previa a la infección por el VHC, pero no puede considerarse un marcador de infección actual. La medición de los niveles de alanina aminotransferasa (ALT), puede considerarse un indicador indirecto de infección, pero no una medición directa de la viremia. De hecho, ALT se puede elevar por otras causas de inflamación hepática. EL VIRUS DE LA HEPATITIS C. CICLO REPLICATIVO. El VHC es un virus pequeño, monocatenario, con una única cadena de RNA y rodeado por una envoltura. Pertenece al género de hepacivirus. Tiene un genoma viral de 9600 nucleótidos, que codifica una proteína de aminoácidos, dependiendo de su genotipo. Su procesamiento da lugar a 10 proteínas maduras que se dividen en proteínas estructurales y proteínas no estructurales. Entre las proteínas estructurales se encuentran el core, que forma la nucleocápside y las glicoproteínas de envoltura. Las proteínas no estructurales intervienen en la replicación viral y procesamiento de la poli proteína. Aunque la mayor parte de la replicación del VHC dentro del huésped, tiene lugar dentro de los hepatocitos, también existe replicación en los ganglios linfáticos y en las células mononucleares de sangre periférica. Aun existen lagunas sobre la replicación del VHC, no se conoce el mecanismo de entada del virus, pero parece que existe una interacción entre la proteína de la envoltura E1 o E2, con moléculas de la superficie celular que actuarían como receptores. Tras la endocitosis, el virus pierde la envoltura, libera su RNA e inicia su ciclo replicativo. La importancia de conocer con exactitud como se produce cada paso del ciclo replicativo del VHC reside en la posibilidad de desarrollar nuevas dianas terapéuticas. Al igual que con el VIH, el bloqueo de los procesos de fijación a la célula diana del virus y la inhibición del

2 procesamiento de las proteínas víricas, constituyen el futuro de dichos tratamientos antirretrovirales. La determinación cuantitativa del RNA del VHC en suero o plasma junto con la presentación clínica y otros marcadores analíticos, conforman la evaluación de la respuesta vírica frente a un tratamiento antirretroviral. Datos recientes indican que las variaciones tempranas en los niveles de RNA del VHC en suero/plasma del paciente, pueden pronosticar las respuestas a largo plazo del tratamiento con antirretrovirales. Por ello, los protocolos de seguimiento y valoración del tratamiento antirretroviral en pacientes con hepatitis por virus C (HVC),incluyen una serie de controles analíticos en fechas concretas. Las determinaciones del RNA del VHC de estos controles, deben proporcionar resultados valorables y concluyentes y son además muestras irrepetibles, dado el momento concreto de su extracción. Desde la implantación en nuestro laboratorio de las primeras técnicas de Biología Molecular para el VHC se establecieron unos procedimientos preanalíticos estándares para la conservación del RNA viral. Estos incluían la separación del suero con material del laboratorio de uso cotidiano y su posterior congelación en forma de alícuotas numeradas. A lo largo de un año aproximadamente, desde Mayo del 2003 a febrero de 2005 se realizaron determinaciones de Cargas virales y RNA del virus de la Hepatitis C. Nos encontramos dentro de este volumen de determinaciones, con las que van a constituir el objeto de nuestro estudio. Observamos la aparición periódica y sin depender del lote de reactivo utilizado de un resultado indeterminado, no valorable clínicamente: La Zona Gris. OBJETIVOS - Depuración de la fase preanalítica de las muestras destinadas a la realización de determinaciones de biología molecular de HVC, como posible responsable de la aparición de zonas grises. - Eliminación de los factores ambientales de posible interferencia en los procesos de separación de muestras. - Mejora del proceso de alicuotación para evitar la contaminación de las muestras. - Mejora del sistema de identificación de muestras para la eliminación de errores numéricos y posterior manipulación de la muestra. - Instauración de plasma como muestra de elección para la determinación de la carga viral del VHC. MATERIAL Y MÉTODOS Existen diferentes técnicas de cuantificación de la CV del VHC (carga viral) y aunque difieren en concepto y práctica, todos están basados en la complementariedad de secuencia del RNA y DNA. Esto proporciona una alta especificidad a la prueba. Casi todos los métodos de cuantificación requieren el aislamiento de las moléculas de RNA previo a la amplificación. Estos sistemas de extracción son en la actualidad automáticos lo que nos evita manipulaciones y por tanto la posibilidad de contaminación de las muestras problema durante dicho proceso. En nuestro laboratorio se instauró el sistema COBAS Ampliprep de Roche Diagnostics, para la fase de extracción del RNA viral. El sistema aísla las moléculas de RNA mediante el uso de sondas de captura específicas para las dianas de carga viral. Para las fases de

3 amplificación y cuantificación se optó en una primera fase por el sistema COBAS amplicor de Roche Diagnostics. Este sistema está basado en 5 procesos fundamentales: 1-Obtención del RNA de la muestra 2-Trascripción inversa para generar el DNA complementario (DNAc) 3-Amplificación por PCR de este DNAc con iniciadores específicos 4-Hibridación de los productos amplificados con sondas oligonucleotídicas para las dianas. específicas 5-Detección por colorimetría de los productos amplificados y unidos a las sondas. Con la lectura colorimétrica, en base a los datos obtenidos con el control interno, procesado junto con la muestra desde el principio, se estima el número de copias de la muestra problema. Si no obtenemos amplificación del control interno, el resultado será anulado. Con posterioridad la detección y cuantificación se realizaron con una tecnología de generación más moderna de la misma casa comercial, la denominada PCR en tiempo real COBAS Taqman HVC de Roche Diagnostics. Esta tecnología esta basada en los mismos procesos principales, pero utiliza sondas fluorescentes doblemente marcadas.el consumo de las sondas produce la liberación del extremo fluorescente. El grado de luminiscencia será proporcional al número copias de RNA viral presentes en la muestra problema. En cuanto al material utilizado durante la fase de preparación de alícuotas de las muestras problema, se acordó la utilización del material disponible en el laboratorio y era el siguiente: - Tubo primario: seco con gelosa, compartido en la mayoría de los casos con otros autoanalizadores. - Tubos Eppendorf con tapón de presión de 1,5 cc, los cuales se suministraban abiertos. 2 por cada muestra problema. - Pipetas Pasteur convencionales limpias, no reutilizables, pero sin sellado ni esterilizado - Chupetes de goma convencionales. - Rotulado manual de las alícuotas: 7 cifras en cada tubo. Los tubos eran manipulados en el banco de clasificación de las muestras de la sección. En estos además se manejan volantes y listados procedentes de las salas de hospitalización, ambulatorios etc. En un extremo del banco estaban las centrifugas. En una segunda etapa y tras concienciarnos del problema que generaban los resultados en Zona Gris, se propusieron una serie de cambios en cuanto a la logística de dicha fase preanalítica y el material a utilizar. Se optó, tras el consenso con la jefa de sección y el supervisor de la unidad, por: - El uso de microtubos estériles de 2 ml. con tapón de rosca modelo Greiner bio-one, los cuales se suministran cerrados y que se servían para el uso de las CV del VIH. - Separación de las muestras con pipeta calibrada, de uso exclusivo para este fin, modelo Finnpipette de microlitros, con puntas desechables y libres de RNA de Barrier 1000, adjudicando a cada alícuota 1200 microlitros de muestra. - Se cambió la ubicación del banco de trabajo del personal encargado de la alicuotación de las muestras para las determinaciones de RNA y CV de VHC, y del VIH habilitándose para

4 ello un departamento anexo al ambiente diáfano de la sección, separado del resto de la plantilla y otras muestras del departamento. - Se retiraron las centrifugas de dentro de la sección situándose en el pasillo con el fin de evitar en lo posible remover partículas ambientales y la formación de aerosoles. - Se generaron etiquetas adhesivas de código de barras a partir del tubo primario, mediante escaneado automático del mismo, que mas tarde se ajustan al formato del tubo elegido, a través de una impresora cebra disponible en el departamento. - Se introdujo una variación en cuanto al tipo de muestra solicitada para dicha determinación de CV de VHC. Se pasó a utilizar al igual que con las CV del VIH, plasma, en tubo de Edta 2K ó 3K de 10 ml. para asegurar el volumen mínimo de muestra necesario para dichas determinaciones. - Se limitó al máximo el uso de tubos primarios que llegan a la sección después de pasar por autoanalizadores de punta no desechable o abiertos con anterioridad al proceso de alicuotación de la muestra. RESULTADOS Desde Mayo de 2003 a Febrero de 2005 se han realizado determinaciones de RNA y CV de VHC. Desde Mayo de 2003 a Marzo de 2004 se analizaron muestras, obteniéndose 19 Zonas Grises, siguiendo la siguiente distribución:

5 Zonas Grises Todas las muestras a excepción de dos, habían sido anteriormente negativas para la determinación de RNA de VHC. Todas fueron negativas en una confirmación posterior.

6 Desde Abril 04 a Febrero 05 se han realizado un total de determinaciones de Biología Molecular de VHC no registrándose ninguna Zona Gris. DISCUSIÓN La CV del VHC se define como el número de copias de RNA del virus de la HVC presentes en una muestra. Básicamente, el sistema de extracción COBAS Ampliprep de Roche Diagnostics, aísla las moléculas de RNA mediante el uso de sondas de captura específicas para obtener el RNA del VHC presente en la muestra, simultáneamente a un estándar de cuantificación, de secuencia muy similar, que se procesa y que actúa como control interno y de referente para el cálculo final del número de copias presentes en la muestra. Posteriormente se realiza una amplificación y cuantificación del RNA extraído siguiendo las técnicas de Cobas Amplicor Monitor y Taqman HVC (Roche Diagnostics). El material de partida es RNA plasmático/sérico al que se añade un control interno de cuantificación que consiste en un número conocido de copias de RNA de tamaño y composición de bases igual al de RNA viral, a excepción de una región interna que las diferenciará en la cuantificación. Un tratamiento inadecuado de la muestra durante el proceso de extracción, amplificación o detección nos anulará el control interno (QS), es decir, si falla el QS el ensayo se anula. En los casos en los que obtuvimos un resultado en Zona Gris el QS era el esperado, luego, no existían factores intrínsecos a la técnica (lote ) que afectaran al proceso. Por tanto, pensamos en la fase Preanalítica como único factor responsable de la aparición de estos resultados indeterminados de las Zonas Grises. Efectuados los cambios propuestos los resultados fueron evidentes. CONCLUSIONES En las nuevas tecnologías de laboratorio de alta precisión, más concretamente, en las de Biología Molecular, resulta importantísimo el tratamiento de la muestra desde los primeros instantes. La Fase Preanalítica es condicionante de los resultados que después obtendremos. A pesar de no representar un número significativo (19 Zonas Grises de un total de ) sí que suponen unas muestras valiosas e irrecuperables, dado el momento concreto de su solicitud. Es por ello que supuso un tema de necesario abordaje y solución. Después de observar el proceso de alicuotación de las muestras y de introducir los cambios consensuados en dicho proceso estamos en disposición de asegurar que es necesario: 1.- Un ambiente lo más limpio posible, asilado del resto de procesos de clasificación de muestras. 2.- El uso de material libre de RNA durante el proceso de alicuotación. 3.- El empleo de un tubo de muestra exclusivo para BIOLOGIA MOLECULAR con el fin de evitar errores de asignación a otras pruebas de carácter preferente (bioquímica, serología, de repuesta rápida ). 4.- Un proceso automatizado de identificación (código de barras) a partir del escaneado del tubo primario para evitar errores que conduzcan a posteriores manipulaciones de las muestras.

7 5.- Seria deseable la instauración de un sistema de alicuotación automatizado (Fase Preanalítica automatizada para BIOLOGÍA MOLECULAR). BIBLIOGRAFIA - Insert Cobas Taqman HVC Test.System Viral Nucleic Acid Kit. - BIOLOGÍA MOLECULAR PARA CLÍNICOS. Vicente Soriano, Juan González Lahoz. Servicio de enfermedades infecciosas, Hospital Carlos III, Madrid

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