Instituto de Innovación en Biotecnología e Industria

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1 Instituto de Innovación en Biotecnología e Industria Centro de Biotecnología Vegetal (CEBIVE) Marcadores moleculares para caracterizar cultivares de aguacates criollos (Persea americana) del tipo antillano, cultivados en la República Dominicana. Investigadora: Ing. Mayelyn Mateo, M.Sc. Junio 8, 27

2 Introducción El aguacate criollo. Generalidades. Importancia: Alimento Variabilidad: Materia prima Reforestación

3 Objetivos Objetivo General: Caracterizar genotipos de aguacates criollos utilizando marcadores moleculares como herramienta. Objetivos Específicos: Caracterizar los aguacates criollos utilizando marcadores moleculares AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphisms). Caracterizar los aguacates criollos mediante la evaluación con marcadores moleculares microsatélites Agrupar los cultivares según la similitud mostrada con los patrones de bandas de isoenzimas.

4 Objetivos Objetivos Específicos: Comparar los resultados de la similitud encontrada según las características fenotípicas, con los resultados de similitud basada en los patrones de bandas de isoenzimas. Sentar las bases para dividir los cultivares criollos existentes en variedades, con nombres con los cuales puedan ser conocidos a nivel nacional e internacional. Hacer selección de variedades con las características requeridas por los mercados internacionales para su comercialización. Contribuir con el desarrollo y competitividad de la industria del aguacate en la República Dominicana.

5 Objetivo Específico No. 3 Agrupar los cultivares según la similitud mostrada con los patrones de bandas de isoenzimas. Análisis de Isoenzimas como Marcadores Moleculares para Evaluar la Similitud entre Aguacates (Persea americana Mill) del Tipo Antillano, Cultivados en la República Dominicana. Elaborada por: Mayelyn Mateo Asesor: Dr. José Núñez Agosto, 26

6 Hipótesis Con isoenzimas como marcadores moleculares, es posible determinar similitud entre los aguacates criollos.

7 Metodología Ubicación de la investigación: Centro de Biotecnología Vegetal (CEBIVE) del Instituto de Innovación en Biotecnología e Industria (IIBI). Material Vegetal utilizado: Frutas maduras y hojas colectadas en las provincias de San Cristóbal (finca de la UNPHU) y Espaillat (finca Educativa). Para el ensayo se seleccionaron 9 árboles y de cada uno se tomaron 3 muestras.

8 Objetivo No. 3A. Elaborar un dendograma donde se agrupen los aguacates según la similitud mostrada con los patrones de bandas de isoenzimas Material biológico: Hojas Procedimiento: consta de tres partes: Extracción de proteínas, electroforesis y tinción de las bandas.. Extracción de la isoenzimas Materiales Hojas jóvenes Nitrógeno líquido Buffer de Extracción: Tris-HCl ph 8.8, Sulfato Dodecil de Sodio (SDS), glicerol, DL-Dithithreitol (DTT) Solución de dilución: Tris ph 6.8, DTT, SDS, glicerol Acetona al 8% y al % Centrífuga Vortex Gasa Papel kimwipe Tubo Falcon Mortero

9 Metodología 2. Electroforesis a) Preparación de la cámara y la gelatina SDS Gelatina de capa superior Materiales: Solución Bis Acrilamida Buffer de gelatina de capa % SDS.5% Persulfato de Amonio N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Agua destilada Gelatina de capa inferior Materiales: Solución Bis Acrilamida Buffer de Resolución % SDS.5% Persulfato de Amonio TEMED Agua destilada b) Preparación de la muestra para electroforesis SDS Materiales: c) Corrida en cámara de electroforesis vertical Sulfato Dodecil de Sodio (SDS) β-mercaptoetanol Bromofenol azul Solución madre de gelatina de capas Sucrosa Agua destilada

10 Metodología 3. Tinción de los patrones de bandas Materiales: Contenedores plásticos Navajitas de afeitar Solución fijadora de gelatina: 5% metanol, 2% ácido acético Tiosulfato de sodio (Na2S2O3.5H2O) Nitrato de plata (AgNO3): 2g/litro,.75 ml/litro de 37% formaldehído solución madre Solución de revelado: (Na2CO3, 6 g/litro,.5 ml de 37% formaldehído solución madre, 4mg/litro Na2S2O3.5H2O) Soluciones de etanol: 5% y 3% Metanol: 5% Zaranda (shaker)

11 Análisis de los datos obtenidos con la evaluación de la similitud entre los cultivares, basada en isoenzimas

12 Análisis de los datos Proteína preteñida A A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A A A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 Representación de los patrones de bandas de isoenzimas presentes en cada aguacate

13 Análisis de los datos Proteína preteñida A A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A A A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 Bandas de isoenzimas, donde y representan la ausencia y presencia de bandas, respectivamente.

14 Análisis de los datos Análisis de similitud. Se utilizará el programa NTSYSpc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System). A B C D E F A,5,333,5 Grado de asociación: B,5,67,4,5,57 J2 = a a + b + c C,67,2,429 D,333,4,2,333,25 F,5,333,5,5,57,429,25,5

15 Resultados con isoenzimas Diagrama de árbol para 9 cultivares Orden de la amalgamación (las distancias son no-monotónicas) Distancias Euclidianas A9 A8 A7 A6 A2 A A A9 A5 A4 A3 A8 A7 A6 A2 A5 A4 A3 A Grupo Miembros A, A3, A4, A5 2 A2, A6, A7, A8, A3, A4, A5 3 A9, A, A, A2 4 A6, A7, A8, A9 Estos resultados permiten aceptar la hipótesis

16 Metodología para Evaluar la Similitud entre los Cultivares según Características Fenotípicas

17 Metodología Objetivo No. 3B Material biológico: Fruto Variables medidas: Contenido de aceite (%) Sabor (evaluación sensorial) Color de la cáscara (evaluación sensorial) Olor (evaluación sensorial) Consistencia de la pulpa (evaluación sensorial) Facilidad del pelado (evaluación sensorial) Dimensiones de la fruta (cm.) Rendimiento (%) Vida de anaquel

18 Análisis de los datos obtenidos con la evaluación de la similitud existente entre los cultivares, basada en características fenotípicas

19 Resultados de la evaluación con características fenotípicas Diagrama de árbol para 9 cultivares Distancias Euclidianas Orden de la amalgamación (las distancias son no-monotónicas) A7 A6 A9 A8 A2 A9 A5 A A2 A5 A A7 A4 A3 A3 A8 A6 A4 A Grupo Miembros A, A2, A5 2 A3, A4, A6, A7, A8, A, A3, A4 3 A9, A, A2, A5 4 A6, A7, A8, A9

20 Comparación de los resultados con isoenzimas y con características fenotípicas Objetivo No. Objetivo No. 2 Grupo Miembros Grupo Miembros A, A3, A4, A5 2 A2, A6, A7, A8, A3, A4, A5 3 A9, A, A, A2 4 A6, A7, A8, A9 A, A2, A5 2 A3, A4, A6, A7, A8, A, A3, A4 3 A9, A, A2, A5 4 A6, A7, A8, A9 Objetivo No.3 Se obtuvo que de 9 cultivares, 5 quedaron distribuidos de igual manera, es decir, en grupos conformados por los mismos individuos.

21 Conclusiones y Recomendaciones

22 Conclusiones Los patrones de bandas de isoenzimas permitieron apreciar diferencias y similitudes entre aguacates que han sido considerados de una misma raza (raza antillana), aunque sólo de forma cualitativa para el caso que nos concierne, por no hacerse en esta investigación la secuenciación de estas biomoléculas. Por consiguiente, se acepta la hipótesis planteada. Se reveló la similitud entre el agrupamiento de los cultivares basado en las características fenotípicas evaluadas y el agrupamiento según los patrones de bandas de isoenzimas.

23 Recomendaciones Continuar con la caracterización de los cultivares utilizando marcadores moleculares de ADN (AFLPs y Microsatélites) PCR

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