METABOLISMO ENERGETICO Y OSMORREGULACION

Transcripción

1 TRABAJO PRACTICO Nº 9 METABOLISMO ENERGETICO Y OSMORREGULACION METABOLISMO ENERGETICO Objetivo general: entrenar a los alumnos en el uso de metodologías relacionadas con la estimación de la tasa metabólica en función de variables relevantes como salinidad del medio acuático, en poiquilotermos. Objetivo particular: Determinar los niveles circulantes de glucosa en hemolinfa de cangrejos, como medida indirecta de los cambios en el metabolismo de estos animales, expuestos previamente a diferentes salinidades ambientales (estrés salino). Especie a utilizar: Machos adultos de Neohelice granulata Materiales y Métodos Variable a medir: Glucosa. A partir de muestras de hemolinfa extraídas de cangrejos expuestos a diferentes salinidades (estrés salino), se medirá el contenido de glucosa utilizando un kit comercial (Kit enzimático para detección de glucosa, Laboratorios Wiener S.A.). Con aguja 27G y jeringa de tuberculina (1 ml) se extraerán ul de hemolinfa de la cuarta o quinta pata de cada cangrejo. La muestra de hemolinfa será colectada en un tubo eppendorf de 500 ul y mantenida en frío para evitar su coagulación. Una vez obtenidas todas las muestras, se determinará el contenido de glucosa, siguiendo este procedimiento: 1) Rotular por duplicado los tubos Khan ubicados en la correspondiente gradilla. 2) Colocar 2 ml del reactivo de trabajo en todos los tubos Khan (utilizar micropipeta P1000) 3) Agregar 10 ul de cada muestra, por duplicado, en el tubo correspondiente (utilizar micropipeta P20) 4) Vortexear y colocar 10 minutos en baño termostático a 37ºC. 5) Medir las muestras en espectrofotómetro a 505 nm (Nota: la curva estándar de glucosa será preparada por los docentes)

2 Diseño experimental: Estrés Salino: los animales serán expuestos a tres (3) salinidades experimentales: 2, 12 y 30 g/l. Para ello, un total de 20 cangrejos serán colocados en peceras de plástico con agua a la salinidad correspondiente, durante la semana previa al trabajo práctico. Cada grupo de alumnos deberá extraerle hemolinfa a dos (2) cangrejos de cada tratamiento: Glucemia (mg/100ml) ES-2 ES-12 ES-30 Cangrejo 1 Cangrejo 2 Tabla de toma de datos para cada grupo de alumnos: Nivel de glucemia (mg/100ml) en cangrejos expuestos a estrés salino. ES-2: tratamiento baja salinidad (2 g/l de sal marina en el agua); ES-12: tratamiento control (12 g/l de sal marina en el agua); ES-30: tratamiento alta salinidad (30 g/l de sal marina en agua). INFORME Objetivo Breve descripción de la metodología utilizada Resultados obtenidos. Mostrar tablas y/o gráficos Analizar el efecto de la salinidad del agua sobre los niveles circulantes de glucosa en poiquilotermos. Relacionar los resultados con el control endocrino de la glucemia en invertebrados.

3 OSMORREGULACION Los invertebrados, peces, anfibios y reptiles que viven en el agua dulce, son hiperosmóticos en relación con su medio ambiente, es decir, que la concentración de osmolitos de sus líquidos corporales excede a la del agua dulce. Todos ellos se enfrentan a dos problemas osmóticos principales: 1. el agua dulce tiende a desplazarse rápidamente a través de cualquier superficie corporal expuesta a ello y a diluir los líquidos corporales, que tienen mayores concentraciones osmóticas con respecto a su ambiente. 2. el agua dulce tiene habitualmente un contenido de electrolitos muy bajo, especialmente de sodio y cloruro, y por ello los animales presentan mayor tendencia a la pérdida de los mismos. En los diferentes animales el proceso evolutivo ha desarrollado tres soluciones generales a este problema: a) disminución de la permeabilidad al agua, b) aumento de la excreción de agua y c) aumento de la captación de iones. Los mecanismos osmorreguladores e ionorreguladores que regulan la presión osmótica y las concentraciones iónicas del compartimiento extracelular del organismo, involucran eventos que controlan las diferencias entre: 1) los compartimientos intracelular y extracelular, y 2) entre el organismo y el medio externo. Los intercambios osmóticos que se producen entre un organismo y su medio pueden ser de dos clases: a) intercambios obligatorios: aquellos que ocurren en respuesta a factores físicos sobre los que el animal tiene muy poco o ningún control fisiológico, b) intercambios regulados: los que controlan fisiológicamente y son capaces de mantener su homeostasis interna. Los animales que mantienen una osmolaridad interna diferente de la del medio en que viven se denominan osmorreguladores, en contraposición de los osmoconformistas, que no controlan activamente la condición osmótica de su medio interno y reproducen pasivamente la osmolaridad del medio ambiente. Diversos animales pueden tolerar solamente un reducido rango de osmolaridad del medio ambiente, por lo cual estos animales fueron llamados estenohalinos. Aquellos que se adaptan y pueden vivir en un ambiente de amplio rango de salinidad (incluyendo agua dulce y salada), se denominan eurihalinos. Un buen ejemplo de este grupo son los cangrejos estuariales, ya que pueden moverse desde el océano hacia un ambiente de agua dulce y regular las concentraciones de iones en su hemolinfa para mantenerlas relativamente constantes frente a cambios en la salinidad ambiental. La capacidad para mantener la osmolaridad de la hemolinfa relativamente constante caracteriza al cangrejo como un animal osmorregulador. Particularmente, en el caso de cangrejos hiperosmorreguladores, cuando migran de un medio ambiente de osmolaridad menor que su hemolinfa, se produce un influjo pasivo de agua y una pérdida de iones. Para reducir estos movimientos pasivos de iones y agua, los cangrejos reducen la osmolaridad de su hemolinfa y la permeabilidad de la superficie corporal. Para compensar el influjo remanente de agua, producen orina por filtración, mediante las glándulas antenales, absorbiendo Na + y Cl - activamente desde el medio externo a través de las branquias.

4 Desarrollo del trabajo práctico Objetivo general: Analizar las propiedades osmorreguladoras en crustáceos frente a diferentes condiciones. Objetivos particulares: Determinar la concentración iónica en hemolinfa de los cangrejos, en respuesta a variaciones en la salinidad del agua. Materiales: Cangrejos. Guantes. Distintas soluciones salinas. Jeringas con aguja 27G. Fotómetro de llama. Tubos Eppendorf. Probetas. Micropipetas. Tips. Procedimiento: Todos los cangrejos a utilizarse serán mantenidos en laboratorio en un medio acuático a una salinidad de 12 (g/l). Aclimatación completa: 3 grupos diferentes de cangrejos N. granulata serán mantenidos durante 1 semana en los siguientes medios salinos: 2, 12, 30. Los animales a 12 serán los controles. 1. Utilizar las muestras de hemolinfa extraídas en el TP de Metabolismo Energético. 2. Medir la concentración de sodio y potasio en la hemolinfa mediante un fotómetro de llama, utilizando una curva de calibración (absorbancia vs. concentración del ión en meq/l). 3. Realizar (para cada ión) curvas de <Ión en hemolinfa> vs. <Ion en agua>. Dilución Muestras de Hemolinfa y agua medio externo: Medición de Iones: Patrón Potasio K + : 5,12 meq/l Patrón Sodio Na + : 141,74 meq/l 1/400 (25 ul de HL ul de agua destilada) Tabla de calibración Fotómetro de llama Dilución Patrón (ul) H 2 O destilada (ul) 1/ / / /800 12,5 9987,5 1/1600 6, ,75

5 4. Completar las siguientes tablas: Iones en Medio Externo Na + K + Iones en Hemolinfa de Cangrejos <Ión> en hemolinfa Na + K + Control Baja S Alta S INFORME Objetivo Breve descripción de la metodología utilizada Resultados obtenidos. Mostrar tablas y/o gráficos Analizar el efecto de la salinidad del medio externo sobre la regulación del medio interno de los cangrejos