MEMORIA DE PRÁCTICAS SILVIA PÉREZ SOLANA

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1 MEMORIA DE PRÁCTICAS SILVIA PÉREZ SOLANA

2 DATOS DE LA EMPRESA Instituto de Biotecnología y Biomedicina de Cantabria (CSIC-UC- SODERCAN), Avda. Herrera Oria s/n. Santander. El tutor CSIC fue Raúl Fernández López y el tutor de la Universidad Fernando Leal Sánchez. El periodo de las prácticas se inicio el 2 julio de 2008 finalizando las prácticas el 29 agosto de Las horas previstas al día son de 8 pero varían según las necesidades de investigación. Se trabaja de lunes a viernes. Estas prácticas están dirigidas a alumnos de 5º curso de Biología/Bioquímica. RESUMEN Dentro de la Biología Sintética, uno de los procesos fundamentales es la construcción y caracterización de partes (Biobricks), que una vez construidas y analizadas se envían al Registro Biológico de Partes Estándar (http://parts.mit.edu/registry/index.php/main_page). A partir de estos Biobricks se diseñan y construyen dispositivos más complejos para el desarrollo de diversos procesos biotecnológicos. Los plásmidos son utilizados como lanzaderas naturales para transportar estos dispositivos hasta las cepas de destino. Un problema esencial para mejorar nuestra capacidad de transportar y hacer funcionar con éxito dispositivos sintéticos en bacterias reside en entender las relaciones que se establecen entre el plásmido lanzadera y la bacteria hospedadora. Los plásmidos naturales han desarrollado mecanismos que les permiten residir en bacterias causando un impacto mínimo sobre su capacidad de supervivencia. Este proyecto tiene como objetivo estudiar las relaciones que establece uno de estos plásmidos naturales, R388, con Escherichia coli, y desarrollar partes sintéticas a partir de él.

3 TÉCNICAS EXPERIMENTALES Y HABILIDADES A DESARROLLAR Técnicas básicas de bioinformática: Diseño de oligonucleótidos, construcción in silico de vectores, búsqueda de homología mediante BLAST, optimización del uso de codones etc Técnicas básicas de biología molécular: PCR, electroforesis en geles de agarosa, clonaje molecular, secuenciación etc Técnicas básicas de microbiología: cultivos bacterianos, antibiogramas, ensayos de fitness y competición etc Técnicas básicas de biología de sistemas (microbianos): perfiles de expresión por sondas fluorescentes, análisis de expresión por citometría de flujo, análisis por PCR cuantitativa. DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS Se quiere estudiar el comportamiento de dos cepas isogénicas de E.coli B, son REL 606 y REL 607. Estas cepas se comportan exactamente igual exceptuando que una no fermenta arabinosa (REL 606) y la otra sí (REL 607). Se quiere ver la influencia de una cepa sobre otra, si afecta positivamente o negativamente o no interfieren. Así pues, el inicio de este estudio es el cultivo de ambas cepas de forma conjunta en el mismo medio. Este inoculo inicial se plaquea en placas petri con un medio especial para el estudio. Este medio es agar convencional rico en arabinosa y contiene un colorante (tetrazolium). Estas dos colonias se diferencian en la mezcla debido a que las Ara+ (fermentan arabinosa) aparecen blancas y las Ara- rojas por la presencia de TTC (tetrazolium) en el medio. La mezcla de ambas cepas se cultiva (37ºC durante 24h) en el tiempo y se hacen plaqueos cada día. Con esto, se hace un recuento del numero de células que hay cada dia 24 horas (unas 20 generaciones). Se ve si unas células decrecen, se mantienen o aumentan. Contando las colonias que crecen en una placa y teniendo en cuenta la dilución plaqueada, se consigue saber el número de células inicial, con el

4 que se comienza este estudio de competencia. Contando las colonias que crecen en placas (que se flaquean cada 24 horas) seguimos el crecimiento de las células en competición. Se va viendo como responde cada población (REL 606 y REL 607) mientras crecen juntas. Al mismo tiempo, se quiere estudiar como afecta el plásmido R388 a la célula hospedadora. Aprovechando que tenemos dos cepas isogénicas con el mismo fitness, se van a utilizar para este estudio. Lo primero que hay que conseguir es tener el plásmido R388 dentro de las cepas REL 606 y REL 607. Se hace por electroporacion. Las células que hayan incorporado el plásmido serán resistentes a trimetropin (TMP), las que no lo incorporen solo serán resistentes a estreptomicina (SM). Así seleccionamos solo las que son resistentes a ambos antibióticos ya que serán que te tengan incorporado el plásmido a estudiar. El protocolo de este estudio es el mismo que el anterior, el cual sirve para control negativo de este nuevo. Si la incorporación del plásmido no afecta en absoluto a la cepa se debe comportar exactamente igual que si no tuviera el plásmido (primer estudio). Estos resultados esta sujetos a una interpretación muy objetiva, ya que el conteo de las colonias (diferenciar entre rojas y blancas) se hace por la persona encargada y no siempre es fácil diferenciar las dos cepas. General mente, ambas cepas (ara+ y ara-) aparecen con un halo blanco a su alrededor, pero unas tienen el interior rosa-fucsia y otras rosa-blanco. Con el objetivo de medir de alguna forma el crecimiento de estas dos cepas cuando lo hacen juntas, se estudio cada cepa con fluorescencia. En este tercer estudio, se quiere introducir fluorescencia roja (plásmido pbad) en una cepa y fluorescencia verde (pbad::gfp). Este plásmido es introducido en la célula por electroporosis. Ahora las células que incluyen este plásmido serán resistentes a Sm y Cm (cloranfenicol). Así vamos a ser capaces de medir el crecimiento de ambas cepas conjuntas y monitorizarlo a tiempo real. Se utiliza un aparato (VICTOR) capaz de medir la D.O del cultivo y la fluorescencia roja y verde. Vamos a ser capaces de describir el comportamiento de una cepa frente a otra a tiempo real. A lo largo del estudio se plaquean las cepas que incluyen el plásmido (con resistencia a uno u otro antibiótico) en placas con agar y el correspondiente antibiótico, con la finalidad de seleccionar solo las células que realmente lo han incorporado. Otra prueba que también se debe realizar, son los antibiogramas.

5 Un antibiograma consiste en crecer un inoculo de una cepa en una placa de agar en la cual se colocan discos de antibiótico a una determinada concentración, a la cual se espere que nuestra cepa sea resistente (se venden comercialmente). Este estudio de competencia se ha realizado según el estudio llevado a cabo por Richard Lenski de la Universidad Michigan State (https://myxo.css.msu.edu/index.html). Lo que se ha querido ver en el laboratorio de genética (Instituto de Biotecnología y Biomedicina de Cantabria (CSIC-UC-SODERCAN)) es la competencia entre cepas con el mismo fitness pero que una tiene incorporado el plásmido R288 contra otra que no lo tiene. ESTUDIO DE LA CONJUGACION BACTERIANA La conjugación bacteriana es el proceso de transferencia de información genética desde una célula donadora a otra receptora, promovido por determinados tipos de plásmidos, que portan un conjunto de genes cuyos productos participan en el proceso, y que requiere contactos directos entre ambas, con intervención de estructuras superficiales especializadas y de funciones específicas (pili sexuales en los Gram negativos, y contacto íntimo en los Gram positivos). Algunos de estos plásmidos se comportan como episomas, es decir, que pueden integrarse en el cromosoma; en este caso, si se produce la conjugación, se puede transferir el propio plásmido más un segmento adyacente del cromosoma, que a su vez podrá recombinarse con secuencias homólogas del cromosoma del receptor, dando lugar a un cromosoma híbrido.

6 Esquema de la conjugación bacteriana. 1- La célula donante genera un pilus. 2-El pilus se une a la célula receptora y ambas células se aproximan. 3-El plásmido móvil se desarma y una de las cadenas de ADN es transferida a la célula receptora. 4-Ambas células sintetizan la segunda cadena y regeneran un plásmido completo. Además, ambas células generan nuevos pili y son ahora viables como donantes. En la conjugación bacteriana, cuando una célula ha cogido un plásmido, ya no quiere otro. Así, se sintetiza una proteína de membrana que dice que ya ha recibido un plásmido. Esta proteína se ha denominado entry exclusión (Eex). El siguiente estudio que se va a realizar durante las prácticas es conseguir eliminar el fragmento génico de esta proteína en el plásmido R388. Se quiere eliminar la secuencia que pertenece a esta proteína. Ahora se va a eliminar la secuencia de Eex mediante la introducción en esa zona de R388, de la secuencia génica correspondiente a la resistencia ante el antibiótico kanamicina (Kn). El proceso consiste en tener la secuencia de la Kn (resistencia a este antibiótico) amplificada. Se obtiene de un plásmido de resistencia a este antibiótico, mediante una PCR común. Se comprueba el tamaño del fragmento ampliado mediante un gel de agarosa. Si el tamaño es el esperado (el numero de bases que tenga esa secuencia de resistencia a la Kn), se purifica la banda en cuestión. Este fragmento de resistencia a la Kn se introduce en las células por electroporacion. Son unas células especiales ya que la maquinaria de precombinación se induce a 40 ºC. Así que como no nos interesa que se de precombinación ya que pueden eliminar el fragmento de su material genético, se plaquean tras la electroporacion a 30ºc durante 24h. Se flaquean en placa con los antibióticos adecuados para seleccionar colonias que realmente hayan incorporado este fragmento de resistencia a la Kn, así que plaquearan en TMP (la cepa ya es resistente a este) y en Kn.

7 Una vez que obtengo colonias resistentes a Kn (por la incorporación del fragmento) y TMP (propio de la cepa), tengo que conocer en que lugar del plásmido R388 se ha incorporado la secuencia de resistencia a Kn. Para esto se realiza una nueva PCR y se comprueba el tamaño del fragmento ampliado y de lo restante (que debe ser un único fragmento correspondiente al plásmido R388 sin Eex). Cuando ya sabemos que tenemos el fragmento de Kn incorporado en R388 y en el sitio correcto (donde debería estar Eex), entonces eliminamos este fragmento de resistencia a Kn mediante enzimas de restricción. El objetivo es quitar la secuencia de Kn que se incorporo a R388 para eliminar Eex; quedando como resultado final, el plásmido R388 sin Eex (y sin lo correspondiente a Kn). Cuando hayamos comprobado que la digestión de ese plásmido es la correcta (el tamaño y numero de bandas en un gel de agarosa tiene que ser lo esperado), se ligan los dos extremos 5 con el 3. Así se habrá construido un plásmido al que se le ha eliminado la secuencia correspondiente a una proteína en concreto. La clave en todo este método (se sigue el método descrito por Wanner) esta en el diseño de los oligos para realizar la PCR. Se debe diseñar un oligo que podemos dividir en tres zonas. 1. la zona correspondiente con el inicio de la secuencia Eex. Aquí se debe guardar una longitud de unos 40 pares de bases de homología con dicha secuencia. 2. una zona que permita el corte a una determinada enzima de restricción (la que se quiera usar). 3. la zona correspondiente al inicio de la secuencia de la Kn. En la primera PCR el oligo diseñado se une al DNA (de donde queramos obtener el fragmento de resistencia a Kn) por la parte aquí descrita como 3. La parte aquí descrita como 1, es para que se reconozca la zona donde empieza Eex y así el fragmento de Kn se introduzca ahí, eliminando la secuencia de Eex. Para comprobar que se ha insertado en la zona donde debería estar Eex se utiliza otra pareja de oligos (la pareja 5-3 y 3-5 ). Se utilizan oligos que amplíen una zona que empiece fuera de la región Kn (la introducida). Así lo que se amplíe será el fragmento entero de la Kn más unos pares de bases por delante y por detrás. Se esperara un fragmento grande, ya que la secuencia para la resistencia a Kn es de unos 1000pb y la que se quiere eliminar, Eex, es de unos 350pb. Como resultado final de este proceso (según wanner) será un plásmido R388 sin la zona que codifica para la proteína Eex. Así las células que tengan el plásmido con la deleción de Eex y ya ligados sus extremos, serán estudiadas. Lo siguiente será ver como afecta la deleción de esta proteína en las células receptoras. Ver como responden en conjugación bacteriana sin la señal que informa de que ya tienen un plásmido incorporado.

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