Cálculo en biología molecular y biotecnología

Transcripción

1 Cálculo en biología molecular y biotecnología

2 A mis padres Mary y Dude, a mi esposa Laurie y a mi apreciada hija Myla.

3 Cálculo en biología molecular y biotecnología Guía de matemáticas para el laboratorio Segunda edición Frank H. Stephenson

4 Edición en español de la segunda edición de la obra original en inglés Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory Copyright Ó 2010 Elsevier Inc. All rights reserved Traducción: Jorge Lloberas Cavero Annabel Valledor Fernández Profesores Agregados de Inmunología, Departamento de Fisiología e Inmunología, Facultad de Biología, Universitat de Barcelona Revisión científica: Francesc Ventura Pujol José Luis Rosa López Profesores de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Ciencias Fisiológicas II, Universitat de Barcelona Ó 2012 Elsevier España, S.L. Travessera de Gràcia, Barcelona, España Fotocopiar es un delito (Art. 270 C.P.) Para que existan libros es necesario el trabajo de un importante colectivo (autores, traductores, dibujantes, correctores, impresores, editores...). El principal beneficiario de ese esfuerzo es el lector que aprovecha su contenido. Quien fotocopia un libro, en las circunstancias previstas por la ley, delinque y contribuye a la «no» existencia de nuevas ediciones. Además, a corto plazo, encarece el precio de las ya existentes. Este libro está legalmente protegido por los derechos de propiedad intelectual. Cualquier uso fuera de los límites establecidos por la legislación vigente, sin el consentimiento del editor, es ilegal. Esto se aplica en particular a la reproducción, fotocopia, traducción, grabación o cualquier otro sistema de recuperación de almacenaje de información. ISBN edición original: ISBN edición española: Producción: Servicios editoriales A. Parras Advertencia La medicina es un área en constante evolución. Aunque deben seguirse unas precauciones de seguridad estándar, a medida que aumenten nuestros conocimientos gracias a la investigación básica y clínica habrá que introducir cambios en los tratamientos y en los fármacos. En consecuencia, se recomienda a los lectores que analicen los últimos datos aportados por los fabricantes sobre cada fármaco para comprobar la dosis recomendada, la vía y duración de la administración y las contraindicaciones. Es responsabilidad ineludible del médico determinar las dosis y el tratamiento más indicado para cada paciente, en función de su experiencia y del conocimiento de cada caso concreto. Ni los editores ni los directores asumen responsabilidad alguna por los daños que pudieran generarse a personas o propiedades como consecuencia del contenido de esta obra. El editor

5 Índice de capítulos CAPÍTULO 1 Notación científica y prefijos métricos... 1 Introducción Dígitos significativos Redondeo de dígitos significativos en los cálculos Exponentes y notación científica Expresando números en notación científica Convirtiendo números en notación científica a notación decimal Sumando y restando números escritos en notación científica Multiplicando y dividiendo números expresados en notación científica Prefijos métricos Factores de conversión y simplificación de términos Resumen del capítulo CAPÍTULO 2 Soluciones, mezclas y medios Introducción Calculando diluciones: una aproximación general Concentraciones por un factor X Preparando soluciones en porcentaje Diluyendo soluciones en porcentaje Moles y peso molecular: definiciones Molaridad Preparando soluciones molares en agua con compuestos hidratados Diluyendo soluciones molares Convirtiendo molaridad en porcentaje Convirtiendo porcentaje en molaridad Normalidad ph pk a y la ecuación de Henderson-Hasselbalch...40 Resumen del capítulo v

6 vi Índice de capítulos CAPÍTULO 3 Crecimiento celular La curva de crecimiento bacteriano Datos de las muestras Ajustando la concentración de células Representando la DO 550 frente al tiempo en un gráfico lineal Representando el logaritmo de la DO 550 frente al tiempo en un gráfico lineal Logaritmos La DO 550 de las muestras convertida a valores logarítmicos Representando el logaritmo de la DO 550 frente al tiempo Representando el logaritmo de la concentración celular frente al tiempo Cálculo del logaritmo de los valores Calculando el tiempo de generación La pendiente y la constante de crecimiento Tiempo de generación Representando los datos del crecimiento celular en un gráfico semilogarítmico Representando la DO 550 frente al tiempo en un gráfico semilogarítmico Calculando el tiempo de generación a partir de un gráfico semilogarítmico de la DO 550 frente al tiempo Representando la concentración celular frente al tiempo en un gráfico semilogarítmico Cómo se obtiene el tiempo de generación directamente de un gráfico semilogarítmico de la concentración celular frente al tiempo Representando la densidad celular frente a la DO 550 en un gráfico semilogarítmico Prueba de fluctuación Ejemplo de la prueba de fluctuación Varianza Cálculo de la tasa de mutación El modelo de distribución de Poisson Cálculo de la tasa de mutación mediante el modelo de distribución de Poisson Aproximación gráfica al cálculo de la tasa de mutación a partir de los datos de la prueba de fluctuación La tasa de mutación calculada mediante la extensión en placas... 78

7 Índice de capítulos vii 3.13 Cálculo de la concentración celular con un hemocitómetro Resumen del capítulo...80 Bibliografía...81 CAPÍTULO 4 Trabajando con bacteriófagos Introducción Multiplicidad de infección (moi) Probabilidades y multiplicidad de infección (moi) Medida del título de fagos Dilución de bacteriófagos Midiendo el tamaño de explosión...95 Resumen del capítulo CAPÍTULO 5 Cuantificación de ácidos nucleicos Cuantificación de ácidos nucleicos por espectroscopia de ultravioleta Determinando la concentración de ADN de cadena doble Utilización de la absorbancia y del coeficiente de extinción para calcular la concentración de ADN de cadena doble Calcular la concentración de ADN como una cantidad milimolar (mm) Determinación de la concentración de ADN utilizando PicoGreen Ò Determinación de la concentración de moléculas de ADN de cadena sencilla La concentración de ADN de cadena sencilla expresada en mg/ml Determinación de la concentración de ADN de cadena sencilla de elevado peso molecular en pmol/ml Concentración de ADN de cadena sencilla expresada como milimolar (mm) Cuantificación de oligonucleótidos Unidades de densidad óptica Expresando la concentración de un oligonucleótido en mg/ml La concentración de un oligonucleótido expresada en pmol/ml Cálculo de la concentración de ARN

8 viii Índice de capítulos 5.6 Peso molecular, molaridad y tamaño del ácido nucleico Cálculo de la concentración de ADN a partir de un gel teñido con bromuro de etidio Resumen del capítulo CAPÍTULO 6 Marcaje de ácidos nucleicos con radioisótopos Introducción Unidades de radiactividad: el curio (Ci) Cálculo del número de copias de un plásmido Marcaje del ADN por traslación de mellas Cálculo del porcentaje de incorporación de marca radiactiva en una traslación de mella Cálculo de la radiactividad específica del producto de la reacción de traslación de mella Marcaje de ADN mediante cebadores aleatorios Marcaje mediante cebadores aleatorios: porcentaje de incorporación Marcaje mediante cebadores aleatorios: cálculo del rendimiento teórico Marcaje mediante cebadores aleatorios: cálculo del rendimiento real Marcaje mediante cebadores aleatorios: cálculo de la actividad específica del producto Marcaje del extremo 3 0 con la transferasa terminal Marcaje del extremo 3 0 con la transferasa terminal: porcentaje de incorporación Marcaje del extremo 3 0 con la transferasa terminal: actividad específica del producto Síntesis del ADN complementario (ADNc) Síntesis de la primera cadena de ADNc Síntesis de la segunda cadena de ADNc Adición de colas homopoliméricas Transcripción in vitro Resumen del capítulo CAPÍTULO 7 Síntesis de oligonucleótidos Introducción Rendimiento de la síntesis...156

9 Índice de capítulos ix 7.2 Cálculo del rendimiento gradual y global por medio del ensayo del catión dimetoxitritilo (DMT) Rendimiento global Rendimiento gradual Cálculo de los micromoles de nucleósido acoplado en cada ciclo de adición de una base Resumen del capítulo CAPÍTULO 8 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Introducción Molde y amplificación Amplificación exponencial Eficiencia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Cálculo de la T m de la secuencia diana Cebadores T m del cebador Cálculo de la T m basado en la concentración salina, el contenido G/C y el tamaño del ADN Cálculo de la T m basado en interacciones entre nucleótidos adyacentes Deoxinucleósidos trifosfato (dntp) ADN polimerasa Cálculo de la tasa de error de la ADN polimerasa Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa Resumen del capítulo Bibliografía Lecturas adicionales CAPÍTULO 9 La reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RT-PCR) Introducción Las fases de la PCR a tiempo real Controles Cuantificación absoluta mediante el ensayo TaqMan Preparación de las diluciones estándar Preparación de una curva estándar para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qpcr) basada en el número de copias La curva estándar Desviación estándar Recta de regresión y la curva estándar

10 x Índice de capítulos 9.4 Eficiencia de amplificación Medición de la expresión génica Cuantificación relativa: el método DDC T El método 2 DDC T : la elección de una referencia endógena El método 2 DDC T : eficiencia de amplificación El método 2 DDC T : está el gen de referencia afectado por el tratamiento experimental? El método relativo de la curva estándar Método de la curva estándar para la cuantificación relativa Cuantificación relativa según cinética de la reacción El método R 0 de cuantificación relativa El modelo Pfaffl Resumen del capítulo Bibliografía Lecturas adicionales CAPÍTULO 10 ADN recombinante Introducción Endonucleasas de restricción Frecuencia de los sitios de corte de las endonucleasas de restricción Cálculo de la cantidad de extremos de fragmento Cantidad de extremos generados por múltiples cortes Ligación Ligación usando vectores derivados de l Empaquetamiento de genomas l recombinantes Ligación con plásmidos Eficiencia de transformación Librerías genómicas: cuántos clones son necesarios? Librerías de ADNc: cuántos clones son suficientes? Librerías de expresión Análisis de librerías recombinantes por hibridación a sondas de ADN Sondas de oligonucleótidos Condiciones de hibridación Hibridación con sondas de ADN de cadena doble (ADNcd)

11 Índice de capítulos xi 10.8 Medición de fragmentos de ADN por electroforesis en gel Generación de deleciones anidadas mediante la nucleasa BAL Resumen del capítulo Bibliografía CAPÍTULO 11 Proteína Introducción Cálculo del peso molecular de una proteína a partir de su secuencia Cuantificación de proteína mediante la medida de la absorbancia a 280 nm Uso de los coeficientes de absorbancia y de extinción para estimar la concentración de proteína Relación entre el coeficiente de absorbancia y el coeficiente de extinción molar Determinación del coeficiente de extinción de una proteína Relación entre la concentración en miligramos por mililitro y la molaridad Cuantificación de proteína mediante A 280 cuando existen ácidos nucleicos contaminantes Cuantificación de proteína a 205 nm Cuantificación de proteína a 205 nm cuando existen ácidos nucleicos contaminantes Medición de la concentración de proteína por ensayo colorimétrico: el ensayo Bradford Utilización de la b-galactosidasa para la monitorización de la actividad de un promotor y la expresión génica Análisis de la b-galactosidasa en cultivos celulares Actividad específica Análisis de la b-galactosidasa a partir de extractos celulares purificados Cromatografía de capa fina (TLC) y el factor de retención (R f ) Estimación del peso molecular de una proteína por filtración en gel El ensayo de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) Cálculo de las moléculas de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT)

12 xii Índice de capítulos Utilización de la luciferasa en un ensayo de gen indicador Traducción in vitro: determinación de la incorporación de aminoácidos El punto isoeléctrico (pi) de una proteína Resumen del capítulo Bibliografía Lecturas adicionales CAPÍTULO 12 Centrifugación Introducción Fuerza centrífuga relativa (FCR) (fuerza g) Conversión de la fuerza g a revoluciones por minuto (rpm) Cálculo de la fuerza g y de las revoluciones por minuto (rpm) utilizando un nomograma Cálculo de tiempos de sedimentación Resumen del capítulo Bibliografía Lecturas adicionales CAPÍTULO 13 Medicina forense y paternidad Introducción Alelos y genotipos Cálculo de las frecuencias del genotipo Cálculo de las frecuencias de alelos La ecuación de Hardy-Weinberg y el cálculo de las frecuencias de genotipos esperadas La prueba de chi-cuadrado: comparando los valores observados frente a los esperados Varianza de una muestra Desviación estándar de una muestra La probabilidad de inclusión (P i ) La probabilidad de exclusión (P e ) Tipificación del ADN y promedio ponderado La regla de la multiplicación Índice de paternidad (IP) Cálculo del índice de paternidad (IP) cuando no se conoce el genotipo de la madre El índice combinado de paternidad (ICP)

13 Índice de capítulos xiii Resumen del capítulo Bibliografía Lecturas adicionales Apéndice A: Uso del excel de microsoft para generar gráficos Índice alfabético...455

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