UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE MEDICINA INSTITUTO DE INMUNOLOGIA CLINICA HERRAMIENTAS MODERNAS PARA EL DIAGNÓSTICO

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1 UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE MEDICINA INSTITUTO DE INMUNOLOGIA CLINICA HERRAMIENTAS MODERNAS PARA EL DIAGNÓSTICO Dra. Haydeé Urdaneta Romero. Junio 2007

2 ABORDAJES DIAGNÓSTICOS IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA PRESENTACIONES CLÍNICAS EVALUACIÓN N DE ANTICUERPOS DIAGNOSTICO DETECCIÓN N DE ANTÍGENOS HALLAZGOS HISTOPATOLÓGICOS

3 CULTIVOS in vivo in vitro A B C D E

4 Evaluación n de la Respuesta Humoral Suero IgG IgM IgA IgE Heces IgA, IgG IgM IgE SALIVA LECHE CALOSTRO Y BILIS IgA Secretora

5 DETECCION DE ANTICUERPOS: : Amibiasis HEPATICA IgM e IgE IgG e IgA IgA Secretoria IgG SéricaS INTESTINAL

6 TÉCNICAS INMUNODIAGNÓSTICAS Dye test Fijación n del complemento Inmunofluores- cencia indirecta Aglutinación directa Hemaglutina. indirecta Reacción intradérmica rmica RIA ELISA Inmunoblot

7 Métodos de Aglutinación Ag o Ac adsorbidos a la superficie de partículas Aglutinación n con látexl Co-aglutinación Proteína A Partículas de latex fragmento Fc Partícula Ag adsorbido Hemaglutinación Glóbulos rojos Aglutinación

8 INMUNOPRECIPITACIÓN

9 ELISA Enzyme linked Inmunosorbent Assay ELISA Ag Muestra Ac Ac Ac ó Ag Ag Producto Coloreado Ac Fase sólidas Conjugado Sustrato En ELISA, uno de los reactivos se conjuga con una enzima formando un complejo con actividad inmunológica y enzimática tica. Engvall y Perlman 1971

10 Método Indirecto Reacción n de color Adición n del cromógeno Y Y Y Y conjugado Y Y Y Y Adición n la muestra Ag Ag Ag Placa sensibilizada

11 COPROELISA-Eh Urdaneta H, Rangel A, Martins S, Muñoz JF & Hernandez M. Ac. Monoclonal kda Ac. Ac. Policlonal (Inmunoafinidad) COPROELISA-Eh Sensibilidad 94.4% 31 ng Especificidad 98.3% V.P.P.: 96.2%. V.P.N.: 97.6%

12 ELISA, Usos: Detección n de Ag y Ac Bacterias Párasitos Hongos Virus Detección n de Complejos autoinmunes anti-dna anti-desoxinucleoproteina anti-histona (H1, H2A, H2B, H3, H4) Lupus Eritematoso sistemico

13 ELISA, Usos:... Detección n de Acs contra Ags del tejído endocrino Anti - tiroglobulina anti-microsomal células de tiroides Detección n de Ags asociados a tumores Ag prostático tico específico Antigeno del ovario (Ca( 125) ACE, alfa-fetoproteina fetoproteina

14 Inmunoblotting (Western blotting) Muestras Papel filtro - Nitrocelulosa Gel Papel filtro + Separación de proteínas por electroforesis en gel Transferencia de proteínas separadas a membrana kda Inmunodetección con Ac marcados Identificación de proteínas específicas

15 A N T I C U E R P O A N T I C U E R P O A N T I C U E R P O INMUNOBLOTING S U S T R A T O S U S T R A T O S U S T R A T O C O N J U G A D O C O N J U G A D O C O N J U G A D O P R O T E I C O P E R F I L

16 NORTHERN BLOT Determinar del PM de ARN Medir cantidades relativas de ARNm presente en diferentes muestras

17 Tecnica basadas en fluorescencia Fluorescencia Inmunofluorescencia Citometría

18 Fluorescencia Liberación de energia Luz visible Electrón Luz de excitación Electrón Electrón Rosse N., and col. 1997

19 Microscopios de fluorescencia Microscopio de luz de trasmición Microscopio de incidencia Microscopio optico de barrido o confocal

20 Otras técnicast REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR). QUIMIOLUMINIS- CENCIA CITOMETRÍA PCR-SHELA LUMINOMETRÍA AUTORADIO- GRAFIA

21 Técnicas moleculares Sondas moleculares Hibridación n en fase sólidas Hibridación n en fase líquidal Hibridación in situ Amplificación n de ácidos nucleicos Amplificación n del blanco Amplificación n de la sonda Amplificación n de la señal

22 Técnicas moleculares... lida Hibridación n en fase sólidas Células intactas Lisis Denaturación del ADN Soporte de nylon o nitrocelulosa Sonda Configuración Revelado Lavado Solución n de hibridación Fijación del ADN dot slot

23 La Quimioluminiscencia 1. Membrana 2. Proteína / Ag 3. Anticuerpo primario 4. Anticuerpo secundario 5. Reactivo Covalight 6. Luz 7. Filtro

24 QUIMIOLUMINISCENCIA 1 DESNATURALIZACIÓN 2 HIBRIDACIÓN 3 CAPTURA 4 MARCAJE 5 DETECCIÓN

25 Técnicas moleculares: Amplificación n del blanco PCR: Polymerase Chain Reaction 5 3 A. ADN doble hebra (molde) B. Denaturación: : 94 ºC Hibridación n de oligos (annealing): 52 ºC C. Extensión: : 72 ºC C (ADN polimerasa). Primer ciclo Productos 3 5 cortos D. Segundo ciclo: Hibridación n de los oligos (en exceso) con los productos de C y acumulación n exponencial de productos cortos en ciclos sucesivos.

26

27 REVELACIÓN PRIMER-DIMERS

28 Principles of in situ PCR performed in cells in suspension

29 VARIACIONES DE LA PCR PCR MÚLTIPLE Q-PCR PCR NESTED PCR in situ RT-PCR

30 RT-PCR Técnica sensible para la detección n de ARNm y para su cuantificación. n. Usos: : clonación, n, construcción n de bibliotecas de ADNc, identificación n de mutaciones y polimorfismo Fases: : *Síntesis de ADNc a partir de ARN por RT y *Amplificación n de un ADNc por PCR Consideraciones: - Aislamiento del ARN -Uso de Primers específicos: Secuencias conocidas -Adición n de tallo poli A al 3 3 terminal. Cuando se conoce sólo s un extremo.

31 Evaluation of newer diagnostic methods for the detection and differentiation of Entamoeba histolytica in an endemic area. A. K. Sharma et al 2003.

32 Comparison of Real-Time PCR Protocols for Differential Laboratory Diagnosis of Amebiasis Qvarnstrom et al 2005

33 BIOLOGÍA A MOLECULAR... LA PCR PERMITE, LA AMPLIFICACION DEL DNA O RNA DEL AGENTE INFECCIOSO Y SU IDENTIFICACION. ES HASTA 100 VECES MAS SENSIBLE QUE OTRAS.

34 PCR Aplicaciones Clínicas 4En infecciones congénitas nitas 4En pacientes Inmunosuprimidos 4Durante la fase aguda 4Prueba de elección n en la evaluación de pacientes con SIDA

35 Técnicas moleculares... Extracción n del ADN/ARN Hacia la automatización... Muestra Amplificación/ secuencia de genes universales Separación electroforética tica Identificación Análisis de banco de datos (secuencias conocidas)

36 Gracias Preguntas?

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