Chlamydia trachomatis-iga-pelisa medac. Castellano 498-TMB-VPS/010708

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1 Chlamydia trachomatisigapelisa medac Castellano TMBVPS/010708

2 FABRICANTE medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg DISTRIBUCIÓN medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103 / Fax: ++49/ 4103 / DIRECCIÓN DE PEDIDOS Tel.: ++49/ 4103 / Fax: ++49/ 4103 / TMBVPS/010708

3 Chlamydia trachomatisigapelisa medac Enzimoinmunoanálisis para la detección de anticuerpos IgA frente a Chlamydia trachomatis Cat. no.: 498TMB PARA USO EXCLUSIVO DE DIAGNOSTICO IN VITRO INTRODUCCION La Chlamydia es una bacteria patógena gramnegativa. Su ciclo de vida es obligatoriamente intracelular, en la superficie de las mucosas y de acuerdo con hallazgos recientes en las células endoteliales y en las células del músculo liso. La Chlamydia es dependiente de fosfatos ricos en energía de sus células huéspedes convirtiéndose, por lo tanto, en parásitos energéticos. El género Chlamydia comprende cuatro especies: C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum y C. trachomatis. C. pneumonie y C. trachomatis son patógenos humanos obligados y C. psittaci es patógena en humanos y en una variedad de especies animales. Hasta el momento C. pecorum ha sido aislada únicamente a partir de muestras de animales. C. trachomatis es uno de los agentes más frecuentes causantes de infecciones de transmisión sexual en el tracto urogenital y en los ojos. C. trachomatis puede transferirse a los niños durante el parto, ocasionando conjuntivitis neonatal y /o pneumonía. C. trachomatis está subdividida en 19 serovariantes que ocasionan diferentes manifestaciones clínicas. Las serovariantes AC son las responsables del tracoma endémico, una enfermedad ocular que puede conducir a la cegera. Esta enfermedad afecta a cientos de millones de personas en las ciudades desarrolladas. El linfogranuloma venéreo, una enfermedad tropical de transmisión sexual, es el resultado de infecciones con los serotipos L 1 L 3. En las ciudades industrializadas los serotipos DK son los más frecuentes causando infecciones oculogenitales por transmisión sexual. En la mayoría de los casos, las infecciones por C. trachomatis en las mujeres cursan asintomáticamente. Esto, provoca muchas enfermedades 498TMBVPS/

4 crónicas ocasionadas por los agentes persistentes en auge. El lugar inicial de la infección es generalmente en el cervix, con la manifestación clínica de cervicitis. La uretritis es menos común en las mujeres. Entre una infección primaria y la aparición de secuelas crónicas a menudo pueden transcurrir meses o incluso años. Las infecciones asintomáticas por C. trachomatis en las mujeres pueden conducir a endometritis, anexitis, periapendicitis, perihepatitis, peritonitis y artritis reactiva. Esta forma de artritis también se conoce en el hombre como artritis posturetral reactiva. Las adnexitis recurrentes, pueden provocar infertilidad secundaria. En los hombres las infecciones ascendentes seguidas de uretritis asintomáticas, pueden desembocar en epididimitis y prostatitis. El proceso inflamatorio correspondiente puede influir en la movilidad de los espermatozoides y en una reacción acrosómica negativa, provocando una fertilidad reducida. El patógeno periférico C. trachomatis puede detectarse con una elevada sensibilidad y especificidad por métodos de laboratorio como ELISA, IFT, PCR, LCR. Estos dos últimos métodos, altamente sensibles se utilizan también para la detección de los agentes patógenos en el eyaculado. La presencia de inhibidores de PCR/LCR conducen a menudo a resultados falsos negativos. El aislamiento clásico de los patógenos a partir de cultivos celulares, presenta problemas debido a la presencia de substancias tóxicas en el semen. Esto ocasiona también resultados falsos negativos. Una posibilidad para evitar estas imperfecciones del diagnóstico se basa en la detección de IgA secretora frente a C. trachomatis en el fluído seminal. La primera respuesta inmune tras el contacto del patógeno con la mucosa genital, es la producción de IgA secretora específica de C. trachomatis. En varios casos la presencia de IgA secretora como única respuesta inmune es indicativo de un proceso local. Además, la detección de anticuerpos en el suero reflejan una diseminación sistémica de la infección. La chlamydia contiene antígenos inmunodominantes comunes como los lipopolisacáridos específicos de género (LPS). Para el diseño de una serología específica de especie, se necesitan estructuras inmunogénicas específicas de C. trachomatis. Estas estructuras se localizan en el dominio variable de la proteína principal exterior de membrana (MOMP). Hasta ahora, el método de microinmunofluorescencia (MIF) es considerado como el método de referencia) para la serología específica 498TMBVPS/

5 de especie. Los antígenos utilizados en la MIF consisten en cuerpos elementales totales purificados y fijados. Debido a ello, no puede excluirse la posibilidad de reacciones cruzadas entre especies. El Chlamydia trachomatispelisa medac utiliza un péptido sintético procedente de la región inmunodominante de los MOMP. Con este antígeno altamente específico es posible discriminar la respuesta de anticuerpos específicos de C. trachomatis de la respuesta de anticuerpos totales frente a chlamydia con elevada especificidad. En infecciones que cursan principalmente de forma crónica la serología es el método de elección. Aquí, la detección de anticuerpos IgA en combinación con anticuerpos IgG juega un papel decisivo. La serología también está indicada como método adicional para el diagnóstico de posibles infecciones periféricas de C. trachomatis y para su seguimiento. 498TMBVPS/

6 PRINCIPIO DEL ENSAYO La placa está recubierta con el péptido sintético específico de C. trachomatis. Los anticuerpos específicos de C. trachomatis presentes en las muestras, se unen al antígeno. Anticuerpos anti IgA humana conjugados con peroxidasa, se unen a los anticuerpos IgA (P = peroxidasa). Incubación con el TMBsubstrato (*). La reacción, se para por la adición de ácido sulfúrico. La absorbancia se lee fotometricamente. Ventajas del ensayo No aparecen falsos positivos ocasionados por reacciones cruzadas con otras especies de chlamydia. El antígeno es un material no infeccioso. Estructura del antígeno definida químicamente. Las tiras de la microplaca contienen pocillos separables, permitiendo un uso eficiente del test. 498TMBVPS/

7 COMPONENTES DEL KIT Cat. no.: 498TMB 1. MTP Microplaca: 12 x 8 pocillos, identificados en color morado, (con el soporte y el desecante sellados al vacío en bolsa de aluminio), divisibles, formau, recubiertos con el péptido sintético, específico de C. trachomatis y NCS, lista para usar. 2. CONTROL Control negativo: 1 vial con 1,5 ml de suero humano listo para usar, teñidos en azul, conteniendo NCS, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 3. CONTROL + Control positivo: 1 vial con 1,5 ml de suero humano listo para usar, teñidos en azul, conteniendo BSA, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 4. WB Solución de lavado: 1 botella con 100 ml de PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, conteniendo ProClin TM BACDIL Diluyente de la muestra: 1 botella con 110 ml de PBS/Tween/NCS, ph 7,0 7,2, listo para usar, teñido en azul, conteniendo ProClin TM CON Conjugado: 4 viales, cada uno con 4,5 ml de inmunoglobulina de cabra anti IgA humana, conjugado con peroxidasa (HRP), listo para usar, teñidos en amarillo, conteniendo BSA, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 7. TMB TMBsubstrato: 1 vial con 10 ml, listo para usar. 8. STOP Solución de parada: 2 viales, cada uno con 11 ml de ácido sulfúrico 0,5 M (H 2 SO 4 ), lista para usar. 498TMBVPS/

8 1. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Material/Reactivo Estado Almacenamiento Estabilidad Kit sin abrir C fecha de caducidad Microplaca abierta C en bolsa 12 semanas con desecante Controles abierto C 12 semanas Solución de lavado diluida C 12 semanas Diluyente de la abierto C muestra 12 semanas Conjugado abierto C 12 semanas TMBsubstrato abierto C 12 semanas Solución de parada abierto C fecha de caducidad No utilizar estos reactivos después de la fecha de caducidad. 2. REACTIVOS Y MATERIALES REQUERIDOS QUE NO SE PROPORCIONAN 2.1. Agua bidestilada. La utilización de agua desionizada puede alterar el procedimiento de la técnica Micropipetas ajustables Contenedores de cristal o de plástico limpios para la dilución de la solución de lavado y de las muestras Sistemas apropiados para el lavado de la microplaca (p.ej. pipeta multicanal o lavador de ELISA) Incubador de 37 C Lector de microplaca con filtros para 450 nm y nm. 3. PREPARACION DE LOS REACTIVOS Antes de comenzar con el procedimiento de la técnica, todos los componentes del equipo deben alcanzar la temperatura ambiente. Calcular el número de pocillos que se necesiten Microplaca La bolsa de aluminio debe cerrarse herméticamente junto con el desecante cada vez que se extraigan los pocillos. El almacenamiento y la estabilidad de los pocillos se indican en punto TMBVPS/

9 3.2. Solución de lavado Mezclar un volumen de solución de lavado (10x) con 9 volúmenes de agua bidestilada (p.ej. 50 ml de solución de lavado (10x) con 450 ml de agua). Para 8 pocillos, se requieren 10 ml de solución de lavado diluída. Si se observan cristales en la solución de lavado (10x), deberán de disolverse por calentamiento (max. a 37 C), y /o agitación a temperatura ambiente. No mezclar los reactivos específicos del ensayo procedentes de diferentes lotes del kit (microplaca, controles, conjugado). En contraste con esto, el diluyente de la muestra, el tampón de lavado, el TMBsubstrato y la solución de parada, son en general reactivos que pueden intercambiarse en todos los kits de medac para Chlamydia y Mycoplasma por ELISA. En general, no se recomienda la utilización de reactivos procedentes de otros fabricantes. 4. MUESTRAS 4.1. El ensayo es apropiado para muestras de suero y de fluído seminal No se necesita pretratamiento del suero y de fluído seminal, como p.ej. inactivación. Sin embargo, no debería estar contaminado con microorganismos ni contener glóbulos rojos. 4.3 Los sueros deben diluirse 1:50 con el diluyente de la muestra. Podrían realizarse diluciones más elevadas para el cálculo del título El eyaculado debe centrifugarse durante 15 min a 600 xg. El sobrenadante (fluído seminal) se procesa para el test El fluído seminal se diluye 1:10 con el diluyente de la muestra. 5.A. PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA 5.1. Cortar la bolsa de aluminio por la parte superior del cierre de cremallera y extraer el número de pocillos de la microplaca requeridos para la realización del test (ver 3.1.). Los pocillos de la microplaca están listos para usar y no necesitan prelavado Pipetear 50 µl del diluyente de la muestra en el pocillo A1 como blanco (ver 6.A.), y 50 µl del control negativo (en duplicado), del control positivo y de las muestras diluídas de los pacientes. 498TMBVPS/

10 5.3. Incubar los pocillos de la microplaca durante 60 min (± 5 min) a 37 C (± 1 C) en una cámara húmeda o alternativamente cubrir la placa con un adhesivo Transcurrido el tiempo de incubación, lavar tres veces cada uno de los pocillos de la microplaca con 200 µl de solución de lavado por pocillo. Verificar que todos los pocillos estén rellenos. Después del ciclo de lavado, sacudir la microplaca en papel secante. No dejar secar los pocillos! Proceder inmediatamente! 5.5. Añadir el conjugado (teñido en amarillo) a cada pocillo. Si el ensayo se realiza manualmente, pipetear 50 µl del conjugado a cada pocillo. Tener en cuenta: Cuando se trabaja con aparatos automatizados, se deben pipetear 60 µl de conjugado a cada pocillo debido a la alta evaporación que se produce en las cámaras de incubación de estos procesadores. Durante la evaluación del test se confirmó la posibilidad de su automatización. Sin embargo, se recomienda verificar la compatibilidad del test con los aparatos utilizados en el laboratorio Incubar nuevamente durante 60 min (± 5 min) a 37 C (± 1 C) en una cámara húmeda o alternativamente cubrir la placa con un adhesivo Transcurrido el tiempo de incubación, lavar nuevamente los pocillos de la microplaca (ver 5.4.) Añadir 50 µl de TMBsubstrato a cada pocillo e incubar en oscuridad durante 30 min (± 2 min) a 37 C (± 1 C ) en una cámara húmeda o cubierta con un adhesivo. Las muestra positivas viran a azul La reacción se para añadiendo 100 µl de solución de parada a cada pocillo. Las muestras positivas viran a amarillo. Limpiar los pocillos de la microplaca por debajo antes de la lectura fotométrica y asegurarse de que no haya burbujas en el interior de los pocillos. La lectura debe realizarse en los 15 minutos siguientes a la adición de la solución de parada. 498TMBVPS/

11 5.B. TABLA PARA EL PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA Diluyente de la muestra Control negativo Control positivo Muestra Blanco (A1) 50 µl Control negativo 50 µl Control positivo 50 µl Muestra 50 µl Incubar durante 60 min a 37 C, lavar 3 x con 200 µl de solución de lavado Conjugado 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Incubar durante 60 min a 37 C, lavar 3 x con 200 µl de solución de lavado TMBsubstrato 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Incubar durante 30 min a 37 C en oscuridad Solución de parada 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leer fotometricamente a 450 nm (ref nm) *) Procedimiento manual/automático(ver 5.5.) 6.A. CALCULO DE LOS RESULTADOS (VALIDACION) Leer los valores de la D.O. a 450 nm (longitud de onda de referencia nm). Restar el valor de la D.O. del blanco (pocillo A1) a todos los demás valores de la D.O. El valor de la D.O. del blanco, debe de ser menor de 0,100. La media del valor de la D.O. del control negativo tiene que ser menor que 0,100 El valor de la D.O. del control positivo tiene que ser superior a 0,800. Cutoff del suero Cutoff = la media de los valores de la D.O. del control negativo + 0,270 Zona dudosa = Cutoff ± 10 % 498TMBVPS/

12 Cutoff del fluído seminal Cutoff = la media de los valores de la D.O. del control negativo + 0,05 Zona dudosa = Cutoff ± 10 % Repetir el ensayo si los resultados no cumplen con las especificaciones. 6.B. EVALUACION DE LOS RESULTADOS 6.B.1. CUALITATIVO Resultado D.O. < zona dudosa D.O. del Cutoff ± 10 % D.O. > zona dudosa Evaluación negativo dudosa positivo 6.B.2. SEMICUANTITATIVO Indice Cutoff: D.O. muestra D.O. Cutoff Evaluación < 0,9 negativo 0,9 1,1 dudosa > 1,1 positivo Las muestras con valores de la D.O. dentro de la zona dudosa, deberían ensayarse nuevamente junto con otra muestra reciente tomada 14 días después, con el objeto de determinar un cambio en el título. Los resultados deberían interpretarse en relación con IgG y los datos clínicos y el resto de parámetros del diagnóstico. Concentraciones elevadas de hemoglobina, bilirrubina y de lípidos en el suero, no influyen en los resultados. 498TMBVPS/

13 6.C. INTERPRETACION ESPECIFICA PARA IgG / IgA EN EL SUERO Posibles Resultados IgG IgA / +/ + +/ +/ + Interpretación 1. IgG e IgA positivo, indica una infección. Otras conclusiones dependen del título y de los síntomas 2. Solamente IgG positiva, indica una infección pasada. En caso de sospecha clínica, comprobar si existe un incremento de 4 veces en el título de la IgG entre dos muestras de suero y retestar la IgA. 3. IgG positiva, IgA en zona dudosa, puede significar una infección reciente o una infección decreciente; retestar IgA transcurridos días. 4. Solamente IgG en zona dudosa, es indicativo de una infección pasada. En caso de sospecha clínica, retestar la IgG e IgA transcurridos días. 5. Solamente IgA positiva; posibilidad de una infección en un estadío muy temprano, o persistencia de IgA. Retestar la IgG e IgA transcurridos días. 6. Solamente IgA en zona dudosa; posibilidad de un estadío muy temprano; Retestar la IgG e IgA transcurridos días. 7. IgG en zona dudosa, IgA positiva; posibilidad de un estadío muy temprano. Retestar la IgG e IgA transcurridos días. 8. IgG e IgA negativas no indica infección. En caso de sospecha clínica justificada debería realizarse una detección directa del antígeno así como retestar la IgA e IgG transcurridos días. Nota: En casos de infecciones agudas recientes de Chlamydia el resultado serológico de los anticuerpos debería ser negativo, a pesar de los síntomas clínicos y el resultado positivo en la detección antigénica. Si se requiere una confirmación serológica de un resultado positivo para el antígeno, o si se requiere seguimiento, se recomienda testar nuevamente transcurridos días para confirmar seroconversión. 498TMBVPS/

14 6.D. INTERPRETACION ESPECIFICA DE IgA EN FLUIDO SEMINAL Resultados Posibles Suero Fluído Seminal Interpretación IgG IgA IgA IgA positivo en fluído seminal; indica una infección por C. trachomatis, restringida a un área localizada. 2. IgA positivo en suero y fluído seminal; indica una infección por C. trachomatis con comienzo de diseminación. 3. Solamente IgA positiva en suero; indica una diseminació tempruna de la infección por C. trachomatis, o IgA persistente. 4. Suero positivo para IgG e IgA y fluído seminal positivo para IgA; indica una diseminación de la infección por C. trachomatis. 5. Suero positivo para IgG y fluído seminal positivo para IgA; indica una diseminación de la infección por C. trachomatis. 6. IgA e IgG positivas en suero; indican una diseminución progresada de la infección por C. trachomatis. 7. Solamente IgG positiva en suero; indica una infección pasada por C. trachomatis. 8. Negativo para todos los anticuerpos; sin indicación serológica de infección por C. trachomatis. 498TMBVPS/

15 7. CARACTERISTICAS DEL ENSAYO Durante la evaluación en el diagnóstico, se determinaron las siguientes características del ensayo. 7.A. ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD Para determinar la especificidad del test se utilizaron sueros procedentes de niños con edad inferior a 10 años y pacientes con infeccion por C. pneumoniae serológicamente probada (MIF). Para la determinación de la sensibilidad/prevalencia, se utilizaron sueros procedentes de tres grupos diferentes de pacientes. Grupo de Pacientes IgA Especifidad IgG Ninos < 10 años 98% (n=100) 99% (n=100) Pacientes con infección por C. pneumoniae (positivos por MIF) 100% (n=47) 100% (n=47) Pacientes STD con cultivo negativo para C. trachomatis C.trachomatispELISA Sensilibidad/Prevalencia 6,2% (n=112) 25,0% (n=96) MIF 3,6% (n=112) 27,1% (n=96) Paticientes STD con cultivo positivo para C.trachomatis 24,6% (n=114) 65,1% (n=106) MIF 20,2% (n=114) 67,0% (n=106) Donantes de sangre Pacientes con artritis¹ C.trachomatispELISA C.trachomatispELISA C.trachomatispELISA 6,4% (n=299) 15,1% (n=299) 41,0% (n=83) 48,2% (n=83) ¹Los sueros fueron preseleccionados de acuerdo a un resultado positivo para la IgG en el relisa de Chlamydia específico de género. 498TMBVPS/

16 7.B. PREVALENCIA Para la evaluación de la prevalencia de anticuerpos IgA de C. trachomatis, se compararon muestras de fluído seminal y de suero procedentes de donantes de semen (hombres fértiles) y de hombres con problemas de fertilidad. Prevalencia* de C. trachomatis de IgA en hombres asintomáticos Donantes de semen (n=116) Hombres con problemas de fertilidad (n=171) Fluído Seminal 9,5%** 26,9%** Suero 5,2% 12,3% * Schuppe et al ** p < 0,05 Hombre con problemas de fertilidad Correlación entre IgA en suero e IgA en fluído seminal Fluído Seminal IgA IgA en Suero (12,3%) (26,9%) 171 El título de IgA en suero y en fluído seminal no correlaciona (p < 0,001) 498TMBVPS/

17 7.C. PRECISION Muestra Variación intraensayo Muestra Variación interensayo (n = 13) Media DS CV (%) n Media SD CV (%) D.O. D.O. CN 0,037 0,007 18,9 21 CN 0,029 0,003 10,3 CB 0,336 0,015 4,5 21 CB 0,314 0,025 8,0 CP 1,346 0,062 4,6 21 CP 1,262 0,069 5,5 N 1 0,144 0,014 9,7 21 N 3 0,112 0,009 8,0 N 2 0,818 0,050 6,1 24 N 4 0,633 0,048 7,6 CN = control negativo; CB = control intermedio (no se incluye en el kit); CP = control positivo ADVERTENCIAS GENERALES SOBRE LA MANIPULACION Para evitar contaminaciones entre muestras, no intercambiar los viales y los tapones de muestras diferentes. Los reactivos deben cerrarse herméticamente, inmediatamente después de utilizarse para evitar la evaporación y contaminaciones microbianas. Tras su utilización, los reactivos deben almacenarse como se ha indicado para garantizar su vida media. Tras su utilización todos los reactivos del kit deben almacenarse en su caja, para evitar mezclar reactivos de diferentes tests o de diferentes lotes (ver 3.). INFORMACION SOBRE SEGURIDAD E HIGIENE Debe cumplirse la normativa sobre seguridad e higiene en el trabajo de cada país. Los reactivos de origen humano han sido testados y se ha encontrado que son negativos para Ag HBs, para anticuerpos frente a VIH1/2 y VHC. A pesar de ello, está altamente recomendado que estos materiales así como aquellos de origen animal (ver contenido del kit) sean siempre manipulados como potencialmente infeccioso y utilizados con todas las precauciones necesarias. CONSIDERACIONES SOBRE ELIMINACION DE LOS RESIDUOS Los residuos químicos y de las preparaciones se consideran en general como material peligroso. La eliminación de estos residuos está regulada a través de las leyes nacionales y regionales y de sus normativas. Contactar con las autoridades locales o con las compañías de gestión homologadas, que aconsejarán del modo en el que se deben eliminar los residuos peligrosos. Fecha de revisión: TMBVPS/

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