ESTUDIO DE LA RED DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN PARA LA FORMACIÓN DE BIOFILM EN

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1 ESTUDIO DE LA RED DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN PARA LA FORMACIÓN DE BIOFILM EN Escherichia coli Pérez Alfaro R. S 1.; Martínez-Antonio A 2.; Hernández Morales A 2. 1 Lic. Biotecnología /Facultad de Química Universidad Autónoma de Querétaro 2 Departamento de Ingeniería Genética, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados, Instituto Politécnico Nacional, Campus Guanajuato, Irapuato RESUMEN La compilación y análisis teóricos de los estudios experimentales nos han mostrado que las actividades de la bacteria son controladas por una red de interacciones entre proteínas reguladoras de la transcripción. El trabajo aquí reportado forma parte de un proyecto que tiene como finalidad entender la dinámica de la actividad de los factores de transcripción que forman una cascada de regulación para la formación de biofilm en esta bacteria. Los resultados aquí reportados, como producto del trabajo durante esta estancia de verano, puso las condiciones para poder continuar con este proyecto. Se trabajo en eliminar resistencias a antibióticos de 12 cepas que deben ser receptoras de las fusiones transcripcionales, mismas que se construyeron en su mayoría. INTRODUCCIÓN Escherichia coli K-12 es la bacteria mejor caracterizada molecularmente, la disponibilidad de la secuencia completa de su genoma ha impulsado su utilización en diversos estudios, entre ellos, entender la organización funcional de su red de regulación transcripcional (Martínez-Antonio y Col, 2008). Los factores de transcripción (FT) son proteínas reguladoras de la transcripción que pueden actuar uniéndose a sitios específicos del DNA, a otros FT o directamente a la RNA polimerasa, su activación o inactivación depende de señales o metabolitos que pueden ser producidas por la célula o percibidas del ambiente. En datos actúales se ha publicado que hay mas de 3000 interacciones regulatorias entre FT y los genes regulados en E. coli (Martínez-Antonio y Col, 2008), en este trabajo se esta interesado en estudiar únicamente aquellas interacciones entre FT y dentro de estas redes se pueden identificar módulos o grupos de factores de FT que regulan: el uso de fuentes alternativas de carbono, integridad del DNA y replicación cromosomal, biosíntesis de aminoácidos, fijación molecular de nitrógeno y sulfuro, respuesta a solventes y ácidos orgánicos débiles, motilidad y quimiotaxis, respiración aeróbica/anaeróbica y destoxificación de bioproductos, respuesta a choque frío y la formación de biofilm, esta última, será la parte en la que se enfoque este trabajo. El biofilm es una comunidad de microorganismos agregados en una superficie por polisacáridos, proteínas y ácidos nucleicos (Wood 2009), el proceso de desarrollo del biofilm se da en cinco pasos: agregación reversible de las células a una superficie, aglomeración irreversible, desarrollo temprano de la arquitectura del biofilm, desarrollo de microcolonias dentro del biofilm maduro y dispersión de las células, estos procesos se encuentran coordinados por largas cascadas de FT regulándose entre sí (figura 1). CsgD es el regulador maestro para la formación de biofilm, YoaD regula de manera especifica la producción de las fibras de polisacáridos para adhesión en el biofilm; además de estos FT directamente relacionados con la formación de biofilm, existen otros FT arriba en la cascada, entre ellos, la proteína receptora de AMPc (CRP), factor for inversion stimulation (FIS), integration host factor (IHFAB), proteína histona (HNS), proteína asociada al nucleoide (HUAB) y el regulador de la biosíntesis para la capsula (RcsAB). Los primeros 4, son considerados reguladores globales (de amplio efecto) y los restantes, locales (de acción restringida). Todos estos FT son el objetivo de estudio principal en este proyecto. 1

2 Figura 1. Red regulatoria para formación de biofilm en E. coli. Los factores de transcripción se encuentran representados por círculos en color azul, las flechas en color verde representan una interacción de activación, mientras que el color rojo representa la inactivación y los números después del nombre están representando el número de genes que son regulados por ese factor de transcripción. OBJETIVO GENERAL Aprender las metodologías de biología molecular que nos permita tener los elementos y construcciones genéticas para estudiar la dinámica de la actividad de los factores de transcripción que forman una cascada de regulación para la formación del biofilm en Escherichia coli. OBJETIVOS PARTICULARES 1. Eliminar la resistencia a kanamicina de las células mutadas en cada uno de los reguladores aquí estudiados de E. coli, (obtenidas de la colección Keio). 2. Diseñar oligonucleótidos para amplificar las regiones promotoras y regulatorias de estos genes reguladores. 3. Hacer las fusiones de las zonas promotoras y regulatorias de los genes reguladores con el gen reportero gfp en los plásmidos y Insertar las fusiones transcripcionales en cada una de las cepas mutadas de los reguladores estudiados. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL Se cuenta con una copia de la colección Keio (Baba y Col, 2006), la cual consiste en cepas mutantes de E. coli K12 MG1655 en cada uno de los genes no esenciales mediante una deleción y sustitución por un cassette que confiere resistencia a kanamicina (Km R ). Por otro lado, se cuenta con un banco de fusiones transcripcionales de E. coli que incluye algunos de las regiones promotoras de este organismo fusionadas al gen reportero gfp sin promotor- (Zaslaver y Col, 2006), a partir de estos recursos disponibles se busca insertar las diferentes fusiones en las cepas de E. coli mutantes, creando así diversas combinaciones de fusiones en fondos mutantes para determinar la influencia regulatoria entre los genes que codifican para la cascada de factores de transcripción que regulan la formación de biofilm (por medio de un análisis de fluorometria). Los materiales biológicos y los métodos de biología molecular empleados en este proyecto los puede encontrar en la siguiente dirección: 2

3 RESULTADOS Para poder llevar a cabo la estrategia experimental aquí propuesta se resolvieron tres detalles técnicos, i) algunas de las fusiones transcripcionales de la biblioteca de fusiones de gfp en E. coli, no contenían las regiones promotoras completas de los genes de interés, por lo que se decidió construirlas de nuevo, la construcción se hizo mediante un PCR usando oligos para 50pb antes y después de la zona promotora, estos productos de PCR fueron ligados a los vectores de clonación para los promotores en la cadena sentido y para los promotores en la cadena antisentido; ii) las mutantes de la colección Keio tienen un cassette de resistencia a km lo que impediría seleccionar las células transformadas con las fusiones transcripcionales, ya que el vector de clonación utilizado ( y Figura 2a) tiene como elemento de selección el gen que codifica para resistencia a km; por esta razón se procedió primero a eliminar el cassette de resistencia a km de el DNA genómico de las mutantes, este procedimiento se llevo a cabo con ayuda de él plásmido pcp20 (fig. 2b) el cual contiene un gen que se activa por calor y que codifica para una recombinasa de levadura (FLP), la recombinasa actúa reconociendo y recombinando sitios blanco al inicio y fin del gen que da resistencia a km, eliminándolo; iii) el tercer obstáculo, se presento una vez que se utilizo el plásmido pcp20 para eliminar la resistencia a km, ya que los vectores de clonación y 139 tienen el mismo origen de replicación (Ori sc101), por lo que es necesario que la bacteria elimine el plásmido pcp20 para que pueda ser transformado de manera estable con las fusiones transcripcionales construidas en los vectores y 139, esto se logro sembrando las células sensibles a km en un medio sin carbenicilina, eliminando así la presión por el antibiótico y dando lugar a que la bacteria deje de replicar el plásmido, seleccionando nuevas generaciones de mutantes sensibles a kanamicina y también a carbenicilina. A) B) Figura 2. Mapa de plásmidos utilizados. A) Mapa del plásmido, usado para la creación de las fusiones transcripcionales. Este plásmido contiene, entre otros, dos sitios de restricción que utilizamos, uno para XhoI y otro para BamHI, entre los que se inserta la zona promotora y reguladora de los genes regulatorios a clonar. Tiene también, un gen reportero que codifica para la proteína verde fluorescente; y un gen que le confiere resistencia a km, como elemento de selección. Se utilizo también otro plásmido, que es muy parecido al anterior, diferenciándose únicamente por que los sitios de restricción para multiclonación se encuentran invertidos. B) Mapa del plásmido pcp20, usado para eliminar la resistencia a km. Este plásmido contiene, entre otros, el gen FLP que codifica para la recombinasa de levadura y el gen Bla que le confiere resistencia a carbenicilina. 3

4 Cepas de E. coli y construcciones genéticas obtenidas en este trabajo Las siguientes cepas y construcciones genéticas fueron obtenidas en este trabajo. A) B) C) Mutantes sensibles a km IHFA - FIS - HUA - HUB - HNS - RcsA - RcsB - CsgD - Mutantes sensibles a cb IHFA - FIS - HNS - CsgD - RcsA - RcsB - HUA - HUB - Fusiones transcripcionales IHFA IHFB FIS HNS CRP CsgD Vector de clonación utilizado A) de las mutantes transformadas se muestra las que perdieron la resistencia a kanamicina por inducción de la recombinasa de levadura contenida en el plásmido pcp20, B) de las mutantes sensibles a kanamicina se muestra las que perdieron por completo el plásmido pcp20, C) se muestra la lista de fusiones transcripcionales obtenidas en los plásmidos y 139. Comprobación de la eliminación del gen que confiere resistencia a Km en cepas de E. coli Figura 3. En esta fotografía se muestra un ejemplo de la electroforesis del PCR para comprobación de la eliminación del gen que confiere resistencia a kanamicina en cepas de E. coli. Carriles: 1, marcador de peso molecular; 2 y 3, controles negativos que consisten en mezcla de reacción y cepa silvestre de E. coli respectivamente; 4, control positivo cepa mutante Hns- resistente a kanamicina tomada de la colección Keio; 5, 6 y 7, cepas mutantes Hns- sensibles a kanamicina. DISCUSIÓN En esta estancia de verano se lograron eliminar el gen que confiere resistencia al antibiótico kanamicina así como del plásmido pcp20 de todas las cepas que se me fueron asignadas. El tener estas cepas en estas condiciones es un requisito necesario para continuar el proyecto ya que estas cepas mutadas en cada uno de los reguladores de la cascada se irán transformando con las distintas fusiones transcripcionales (plásmidos) para medir la actividad de los promotores mediante la fluorescencia de la proteína GFP. Así mismo en este trabajo logramos hacer 6 de las 12 fusiones transcripcionales requeridas. CONCLUSIÓN Y PERSPECTIVAS El trabajo se desarrollo de manera adecuada pero debido, principalmente a la falta de tiempo no se pudo avanzar mas en el. Los resultados fueron muy positivos y serán sumamente útiles para continuar el proyecto. Desafortunadamente ya no se pudieron concluir los experimentos en donde se pueda determinar la influencia regulatoria entre los genes que codifican para la cascada de factores de transcripción que regulan la formación de biofilm, por medio de un análisis de fluorometria; a través de 4

5 estas estrategias se intenta conseguir la información para establecer las proporciones y la importancia de cada uno de los factores de transcripción involucrados en la cascada regulatoria para la formación del biofilm. Sin embargo con este trabajo se sentaron las bases para poder lograr esto. AGRADECIMIENTOS Agradezco al Verano de la Ciencia Región Centro por brindarme la oportunidad de hacer esta estancia académica. Al Laboratorio de BioSistemas del Dpto. de Ingeniería Genética del CINVESTAV Irapuato por brindar la infraestructura y materiales requeridos, al Dr. Agustino Martínez-Antonio por permitirme colaborar dentro de su proyecto y al MC. Alejandro Morales Hernández por guiarme con las técnicas y metodologías aquí empleadas. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS B. Wanner, y H. Mori Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. Baba, T., T. Ara, M. Hasegawa, Y. Takai, Y. Okumura, M. Baba, K. Datsenko, M. Tomita, Datsenko, Kirill A. y B. L. Wanner One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. 12, Martínez Antonio, A., S. Chandra y D. Thieffry Functional organization de Escherichia coli transcriptional regulatory network. J. Mol. Biol. 381, Pru ß, B. M.; C. Besemann, A. Denton, y A. J. Wolfe A Complex Transcription Network Controls the Early Stages of Biofilm Development by Escherichia coli. Journal of bacteriology. 11, Wood, T. K Insights on Escherichia coli biofilm formation and inhibition from wholetranscriptome profiling. Environmental Microbiology.11, Zaslaver, A.; A. Bren; M. Ronen, S. Itzkovitz, I. Kkikoin, S. Shavit, W. Liebermeister, M. Surette, y U. Alon A comprehensive library de fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 8,