DIFERENTES MODELOS DE VIDEO TIME- LAPSE Y SU APLICACIÓN EN LAS CLÍNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA

Transcripción

1 Máster en Biología y Tecnología de la Reproducción DIFERENTES MODELOS DE VIDEO TIME- LAPSE Y SU APLICACIÓN EN LAS CLÍNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA JUNIO 2013 Paula Fanjul González

2 JOSE LUIS DE PABLO FRANCO, embriólogo y director del laboratorio de Fecundación In Vitro de la clínica de reproducción asistida Quirón Bilbao. CERTIFICA: Que el trabajo presentado por DÑA. PAULA FANJUL GONZÁLEZ, titulado DIFERENTES MODELOS DE VIDEO TIME- LAPSE Y SU APLICACIÓN EN LAS CLÍNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA realizado bajo la dirección del Dr. Jose Luis de Pablo Franco, dentro del programa de Máster en Biología y Tecnología de la Reproducción, reúne a su juicio las condiciones necesarias para ser admitido como trabajo fin de master. Y para que así conste dónde convenga, firma la presente certificación en Bilbao a 5 de JUNIO de 2013

3 Quisiera expresar mi agradecimiento a todo el personal de la clínica de reproducción asistida Quirón Bilbao por hacer que mi tiempo con ellos fuera el mejor posible, en especial a Jose por darme la oportunidad de hacer este trabajo y por ofrecerse a ello. A Abel por haber dedicado su tiempo a corregir mi trabajo y ayudarme a perfeccionarlo. A mi Familia, tanto la de aquí como la del Sur, sin su apoyo y esfuerzo esto no hubiera sido posible. A ti, Sergio, porque a pesar de que estés lejos, me acompañas en todo lo que hago. A mis amigos, que siempre están ahí, incondicionalmente. Y sobre todo gracias a vosotras, que habéis hecho de este año no tan bueno uno de los mejores. Este trabajo va por vosotras.

4 ABREVIATURAS ASEBIR = Asociación española para el Estudio de la Biología de la Reproducción EEVA = Early Embryo Viability Assessment test ESHRE = European Society of Human Reproduction and Embryology ESSP = Embryonic Stage- Specific Patterns FIV = Fecundación In Vitro ICSI = Inyección espermática intracitoplasmática MCI = Masa Celular Interna PN = pronúcleo qrt- PCR= real- time polymerase chain reaction TE = trofoectodermo WOW = well of the well ZP = zona pelúcida

5 ÍNDICE INTRODUCCIÓN OBJETIVOS ANÁLISIS EEVA Embryoscope Primo Vision Comparación de los 3 sistemas DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA

6 INTRODUCCIÓN El desarrollo embrionario comprende diferentes fases a través de las cuales, de la unión de dos células haploides obtenemos un ser pluricelular diploide. De estas fases, las que de verdad interesan a los laboratorios de reproducción asistida son las que se producen en los primeros 6 días, días en los cuales el embrión será controlado por el personal del laboratorio para posteriormente realizar la transferencia y obtener un embarazo. La fecundación es un fenómeno que consiste en la activación del ovocito I por penetración del espermatozoide, el cual aportará el centriolo proximal que estará implicado en las divisiones mitóticas posteriores y en la fusión de pronúcleos de ambos para la restauración del número diploide de cromosomas. Para atravesar la zona pelúcida (ZP) que rodea al ovocito, el espermatozoide se une con los receptores ZP3. Esta unión provoca la reacción acrosómica produciéndose un aumento del calcio intracelular, lo que desencadena la fusión de la membrana interna del acrosoma con la membrana plasmática, liberando enzimas con las que consigue perforar la ZP y posteriormente la membrana del ovocito. (Rohen y cols. 2008) Una vez perforadas estas dos estructuras junto con el contacto directo con el ovocito, se da la reacción cortical que consiste en la liberación del contenido de los gránulos corticales del ovocito, lo cual es un mecanismo para evitar la polispermia ya que endurece la ZP además de cambiar la polaridad de la membrana. Esta liberación también provoca oscilaciones de calcio lo que hace que el ovocito que estaba parado en metafase II, finalice la meiosis, pasando rápidamente a anafase II produciéndose la extrusión del segundo corpúsculo polar y la formación del pronúcleo (PN) femenino. Al mismo tiempo que la maduración finaliza, el pronúcleo del espermatozoide va aproximándose al femenino.(boiso y cols. 2002) En este momento tendremos los dos PN juntos, uno al lado del otro. Estas dos estructuras iniciaran una duplicación del DNA que cuando finalice, dará paso a la desintegración de las membranas de los PN para que estos se fusionen. 1

7 Inmediatamente después los cromosomas, tanto maternos como paternos, se alinean en la placa ecuatorial iniciando la primera de muchas divisiones mitóticas. Las divisiones que experimenta son equivalentes, es decir, ambas células que surgen son iguales; a este proceso se le llama segmentación. Está divisiones irán aumentando el número celular de forma exponencial, pasando de 2 células, a 4, a 8 hasta alcanzar las 16 células. Una vez en el estadio de 16 células comenzará la formación de la mórula, una estructura con células aglomeradas y cuya finalidad es la de aumentar el material genético y restituir las relaciones nucleocitoplasmaticas además de las formación de elementos celulares pequeños que ayudarán a las células en los procesos de diferenciación y crecimiento.(niakan y cols., 2012) Cuando la mórula alcanza cierto volumen celular esta empieza a compactarse para formar el blastocito, una estructura con dos tipos celulares diferenciados, el trofoectodermo (TE) y la masa celular interna (MCI) que formarán la placenta y el embrión en sí, respectivamente. Imagen 1. Desarrollo embrionario hasta día 6 El trofoectodermo está compuesto por una monocapa de células muy unidas entre si y con microvellosidades. Este, a su vez, se organiza alrededor de la masa 2

8 celular interna que se encuentra en el interior de la cavidad formada por el TE y rellena por el blastocele. Esta estructura, una vez formada por completo, iniciará un proceso mediante el cual saldrá de la zona pelúcida que le rodeaba hasta este momento para poder invadir el endometrio materno y así poder seguir desarrollándose hasta alcanzar la condición de embrión. Dentro del contexto de un laboratorio de reproducción asistida, el blastocito sería el último estadio en el que el embrión podría permanecer dentro del incubador ya que, una vez iniciada la eclosión, ya estará preparado para ser transferido al útero materno para así iniciar su posterior desarrollo.(niakan y cols., 2012) Método actual de clasificación (Clasificación de ASEBIR) Es el método utilizado actualmente en los laboratorios de reproducción asistida de España para elegir al embrión con la máxima calidad posible.(asebir 2009) Basado en la valoración morfológica, se sirve 5 parámetros clave para estimar la calidad del preembrión o blasto: Número de células % Fragmentación Simetría Multinucleación Vacuolización Estos serían los parámetros más relevantes aunque dependiendo del estadio que se mire, se evalúan otros que pueden ser indicadores de buena o de mala calidad. Parámetros observados en D+1: Número y apariencia de los corpúsculos polares Número y apariencia de PN o Simetría o Sincronía 3

9 o Localización o Número de precursores nucleolares Halos citoplasmáticos División temprana Halo citoplasmático Pronúcleo Precursor nucleolar Corpúsculo polar Imagen 2. Zigoto Parámetros observados en D+2, D+3: Número celular y ritmo de división % fragmentación (normal en embriones humanos) à aparte de evaluarse el tanto por ciento, se analiza el tamaño de esos fragmentos y su disposición en el embrión para estimar en que punto se puede considerar como factor negativo. o < 10% o 11-25% o 26-35% o > 35% Cuando la fragmentación es de más del 35% hablamos de fragmentación tipo IV (Alikani y Cohen, 1995) à fragmentos de gran tamaño repartidos por todo el embrión Simetría de las blastómeras o Blastómeras iguales o Blastómeras diferentes Anillo acitoplasmático à citoplasma retraído o Ausencia o Presencia 4

10 Vacuolización o Ausencia o Vacuolas pequeñas > 5 microm o Abundantes Aspecto de las ZP o Normal o Anormal Grados de compactación celular Pitting o moteado Parámetros observados en D+4: Compactación de las blastómeras Parámetros observados en D+5, D+6: Organización blasto Grado de expansión del blastocele Aspecto de la ZP à Van a la par, a medida que aumenta el blastocele la ZP se va afinando Aspecto del TE o Monocapa homogénea de células elípticas o Monocapa irregular o Monocapa irregular con pocas células Aspecto de la MCI o Tamaño de con aspecto oval y compacto o Tamaño < 1900 con diferente aspecto al oval y compacto % fragmentación Vacuolización à Posibles signos de inicio de apoptosis 5

11 Con todas las observaciones recogidas a lo largo del desarrollo preimplantacional del embrión, se establece una estimación de la calidad. Por tanto, esta clasificación tiene en cuenta la evolución del desarrollo, es decir, cuando se evalúa en un cierto estadio, siempre se tiene en cuenta el anterior para considerar que verdaderamente ese embrión ha seguido un desarrollo correcto. Esta clasificación se divide en 4 categorías que tienen en cuenta el potencial implantatorio del embrión o blasto, la cual se explica brevemente a continuación: Categoría A = óptima calidad con máxima capacidad implantatoria Categoría B = buena calidad con elevada capacidad implantatoria Categoría C = calidad regular con una capacidad implantatoria media Categoría D = mala calidad con baja capacidad implantatoria Para la clasificación del embrión en D+2, D+3 se tomarían las referencias de la tabla, que recoge un resumen de las pautas recogidas por ASEBIR: Categoría Evolución D+2 a D+3 % Fragmentación Simetría Vacuolización Multinucleación A 4 células a 7-8 células Menos del 10% Todas iguales o semejantes Ausencia Ausencia B Incremento de 3-4 Hasta un 25 % Todas Ausencia Ausencia células (cualquier iguales o combinación) semejantes C Incremento de 1-3 Hasta un 35% Desiguales Ausencia o Ausencia células (cualquier pocas combinación) D Incremento de una sola célula Más de un 35% Desiguales Abundantes Presencia 6

12 Imagen 3. D+2 (4 células) Imagen 4. D+3 (8 células) En el caso de los blastos, cambian los parámetros que se observan por lo que obtenemos otra tabla con la que clasificarlos: Categoría Organización en Zona MCI Tamaño TE Grado de blastocito pelúcida MCI expansión A En D+5 Afinada Oval y 3800 Epitelio El blastocele en D+5 compactada 1900 µm² homogéneo ocupa todo el en D+5 con células volumen del elípticas embrión B En D+5 Afinada Oval y 3800 Epitelio en D+5 compactada 1900 µm² irregular en D+5 C En D+6 _ < 1900 µm² D En D+6 _ <1900 µm² Epitelio homogéneo con células elípticas Epitelio irregular y escaso número de células 7

13 Masa celular interna Trofoectodermo Imagen 5. Blastocisto Imagen 6. Blastocisto eclosionando Por qué se establece una clasificación embrionaria en los laboratorios? Como se ha dicho anteriormente, el desarrollo embrionario en los primeros días es crucial para los embriólogos que trabajan en una unidad de reproducción asistida ya que de la clasificación de los embriones en sus distintas fases, se tomará decisiones cruciales. Estas decisiones comprenden: Qué embrión o embriones se van a transferir Qué día es el más idóneo para transferir Qué embrión o embriones son aptos para la congelación Qué embrión o embriones se desechan Por lo tanto, un seguimiento de los mismos a lo largo de los días en los que estarán dentro del incubador, es totalmente indispensable para obtener resultados óptimos. Funcionamiento básico del Video Time- Lapse y su aplicación El método del Time- Lapse es una herramienta que permite observar un suceso que por lo general sucede a una velocidad tan pequeña que es imperceptible en su totalidad. Esto se consigue con la captura de multitud de fotografías fijas a 8

14 determinados intervalos de tiempo para obtener una película gracias a la unión de las imágenes obtenidas del proceso a una velocidad establecida.(mio y cols. 2008) En el ámbito del laboratorio de reproducción asistida esto permite observar el desarrollo temprano del embrión sin necesidad de sacarlo del incubador, aportando mayor detalle de este proceso, ya que no solo se observa en los días citados anteriormente, sino que el seguimiento es continuo. Por lo tanto, qué beneficios aporta esta técnica a la hora de evaluar la calidad de un embrión?. Aún hay obstáculos que solventar para afinar más la técnica para que de verdad estemos escogiendo el mejor embrión?. Analizando la técnica podemos decir que aporta ventajas a la hora de ser comparada con el método tradicional de estudio (C Wong y cols. 2013), una de ellas, dicha anteriormente, es la capacidad de tener en observación continua al embrión pudiendo elegir el intervalo al que se le quiere sacar la imagen, claramente más ventajoso que sacarlo del incubador y observarlo únicamente en determinadas fases del desarrollo, además esto permite monitorizar el proceso de desarrollo con mucho mas detalle, lo que posibilitará una interpretación de la morfología mucho más exacta. Otra de las ventajas de la técnica de Time- Lapse es la de poder mantener a los embriones en un incubador con las condiciones adecuadas mientras se encuentran en el laboratorio, pudiendo así disminuir los posibles daños producidos durante el proceso, además de evitar los posibles accidentes que se pueden dar al sacar las placas cada día del incubador. (Nakara y cols. 2010) Siguiendo con las ventajas de este método, deberíamos nombrar también que este proceso continuo de captura de imágenes se puede acoplar a un software que permite analizar la imagen mas detalladamente, aumentando el tiempo de observación, ya que con el método tradicional, el embrión puede estar fuera un determinado tiempo porque cuanto más tiempo esté fuera de las condiciones óptimas, peor será para su integridad. Por último, decir que la técnica de Time- Lapse puede combinarse con herramientas moleculares que permiten analizar el comportamiento del embrión y sus fundamentos moleculares durante estas fases tan tempranas de desarrollo; aunque orientado para una aplicación en investigación animal, podría dar 9

15 información sobre el comportamiento de una determinada molécula que posteriormente ayudaría a comprender mejor la dinámica que lleva un embrión durante su desarrollo.(wale y cols. 2010; Loewke y cols. 2011) Por lo tanto, con este método nace una nueva forma de clasificar embriones que, unida con el método tradicional, aporta resultados mas exactos de la calidad. Pero no todo son ventajas a la hora de hablar del método de Time- Lapse. Uno de esos inconvenientes (C Wong y cols. 2013) es que el embrión es una estructura móvil que se desplaza dentro del medio que lo contiene, por lo que se puede hacer difícil mantener el embrión continuamente en la misma posición, dentro del campo de visión del microscopio, para que el proceso salga adecuadamente, además, añadido a esto, normalmente el cultivo estándar de embriones requiere cambios de medio durante la incubación, lo que empeoraría lo dicho anteriormente. Otro de los problemas asociados a esta técnica es que los embriones son también muy sensibles a la luz pudiendo causar daños en el DNA, liberación de radicales libres o sobrecalentamiento del embrión en determinadas zonas. Por último, no se ha observado aun que esta técnica aporte diferencias significativas en el porcentaje de embriones de buena calidad comparándola con el método de clasificación tradicional, aunque aún es pronto para sacar conclusiones ya que esta tecnología lleva muy poco tiempo en el mercado y, de momento hay pocos estudios que puedan demostrar su auténtica utilidad a la hora de elegir el mejor embrión para ser transferido. Método nuevo de clasificación embrionaria ( Morfocinética) Para finalizar, de todo lo expuesto anteriormente sobre el método tradicional y del funcionamiento básico del Time- Lapse, podemos decir que surge una nueva corriente de clasificación embrionaria gracias a la observación del ritmo de división y de cómo se da esa división de las blastómeras dentro del embrión. Esta nueva forma de clasificación, unida a la clasificación morfológica, aumenta las posibilidades de elegir el mejor embrión para ser transferido. 10

16 La clasificación morfocinética se basa en la medición del tiempo que tardan en producirse diferentes sucesos fundamentales en el desarrollo embrionario temprano como pueden ser, por ejemplo, el tiempo que tarda en desaparecer el pronúcleo o cuántas horas transcurren hasta que se produce la primera división. También se mediría el tiempo que tardan en aparecer los núcleos de las blastómeras después de que se produzca la división o la desaparición de los mismos antes de que comience la segunda división (JG Lemmen y cols. 2008). Otro parámetro que mide esta nueva forma de clasificación, a parte del ritmo de división, es la sincronización de la misma, es decir, la aparición de los núcleos de las nuevas blastómeras a la vez. Por lo tanto, este método, de forma resumida, se basa en el análisis del ritmo de división y de la sincronía. En un estudio llevado a cabo por Wong y cols. (2010), que se explicará con más detalle, combinaron estas 2 categorías de parámetros: por un lado morfológicos (tamaño de la blastómera, grosor de la ZP, % de fragmentación) y por otro los morfocinéticos, tanto el ritmo de división como la sincronía. Para medir el ritmo de división se tomaron 3 momentos clave: Duración de la primera división Intervalo de tiempo entre el final de la primera mitosis y el inicio de la segunda Intervalo de tiempo entre la segunda división y la tercera junto con la sincronización que se da entre las dos Imagen 7. Parámetros medidos. Tomado de Wong y cols. Non- invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predict development to the blastocyst stage, octubre 2010 Nat Biotech 28,

17 De este estudio se obtuvieron unos valores medios de duración de los distintos momentos observados: (Estos valores serían para un embrión que alcanza el estado de blastocito) Tiempo de la primera división = 14 ± 6 mins. Intervalo de tiempo entre la primera y la segunda división= 11 ± 2 h Intervalo entre la segunda división y la tercera= 1 ± 1,6 h Esto valores serían predictivos, es decir, calculando los tiempos nombrados, si el embrión se encuentra en ese intervalos, se podría predecir si va a alcanzar el estadio de blastocito a partir del tiempo tomado en D+2 o D+3 Imagen 8. Desarrollo humano temprano. Tomado de Timing is everithing in the human embryo Ann A Kiessling, octubre 2010 Nat Biothech 28,10 Siguiendo con la temática de este nuevo método, muchos otros autores han trabajado con ello (Cruz y cols., 2012 ; Dal canto y cols., 2012 ; Herrero y cols., 2013), uno a mencionar es Meseguer y cols. y su trabajo sobre la morfocinética como método predictivo de implantación. En el también se analizan distintos tiempos de división que se detallan en la imagen 9: t2= tiempo de la primera división t3= tiempo de la segunda división t4= tiempo de la tercera división t5= tiempo de la cuarta división cc2= duración del segundo ciclo celular (t3- t2) s2= duración de la transición entre el embrión de 2 células y el de 4(t4- t3) 12

18 Imagen 9. Tomado de Meseguer y cols The use os morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Hum Reprod. 26, Estos tiempos se combinaron con una clasificación morfológica común en la que se miró el número de células, la simetría, % fragmentación, presencia de multinucleación, entre otras, formándose así un árbol de clasificación que serviría como herramienta para predecir el potencial de implantación de cada embrión. Para este árbol, se tomaron como criterios morfocinéticos el tiempo que duran las divisiones hasta el estadio de 5 células (t5), la sincronización de las divisiones después del estadio de 2 células (s2) y la duración del segundo ciclo celular (cc2), de los cuales ya se habían obtenidos rangos de valores en lo que se ha de encontrar el embrión. Con todo esto se obtiene el siguiente modelo que clasifica el embrión dentro de 10 posibles categorías, de mayor a menor potencial de implantación. (Aà F) 13

19 Imagen 10. Árbol de clasificación jerárquica. Tomado de Meseguer y cols The use os morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Hum. Reprod. 26, En la tabla que se muestra a continuación se puede ver un correlación entre clasificar el embrión a partir del árbol creado por Meseguer y cols. y el % de implantación de esos embriones, se ve claramente que con ella se puede llegar a establecer que embrión será mas apto para transferir y conseguir así un embarazo. Tabla 1. Tomado de Meseguer y cols The use os morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Hum. Reprod. 26,

20 Los resultados obtenidos en este estudio serían posteriormente afirmados como indicadores estadísticamente significativos en el desarrollo a blastocito, gracias al estudio llevado a cabo por Cruz y cols. en Por qué exponer estos resultados? Simplemente para que sirvan como herramienta explicativa de lo que aporta la tecnología de Time- Lapse a favor de una clasificación mejorada y más exacta. Si bien en los dos casos anteriores se han explicado como puede usarse esta nueva tecnología para predecir si el embrión va a conseguir llegar al estadio de blastocito o cuál será su potencial de implantación, también sirve como herramienta para establecer la calidad del mismo (Arav y cols. 2008; Cruz y cols. 2012; Dal Canto y cols. 2012) o como modelo para predecir aneuplodias o poliploidías (Chavez y cols., 2012; Campbell y cols., 2013; Montag 2013). En resumen, de todo esto se puede concluir que los métodos de Time- Lapse proporcionan una nueva forma de clasificación gracias a la observación directa del momento de división de las células, respaldado por multitud de estudios que determinan que las divisiones tempranas son un buen indicador del desarrollo, comparándose con zigotos que tardan más tiempo. (Van Montfoort y cols., 2004) 15

21 OBJETIVOS El objetivo de este trabajo es el de analizar los distintos sistemas que hay de Time- Lapse en el mercado para establecer cual de ellos es mas útil a la hora de incorporarlo a un laboratorio de reproducción asistida como método de clasificación embrionaria. Para ello se analizaran a fondo los 3 sistemas actuales, el Embryoscope, el EEVA y el Primo Vision además de hacerse una comparación entre ellos junto con las ventajas e inconvenientes que pueden tener cada uno. 16

22 ANÁLISIS EEVA (Early Embryo Viability Assessment test) El EEVA es un pequeño microscopio que encaja dentro de un incubador estándar. Este toma imágenes, en campo oscuro, del embrión a intervalos determinados de tiempo que posteriormente serán analizadas por un software que evalúa constantemente diferencias críticas y sutiles dentro de las divisiones celulares de cada embrión para determinar su viabilidad y el potencial que tiene cada uno para desarrollarse. Imagen 11. Análisis del desarrollo del embrión en los primeros días El cultivo de los embriones es llevado a cabo en el interior de una placa de Petri, dentro de la cual hay micropocillos donde irán colocados los embriones (cultivo en grupo). Imagen 12. Placa de cultivo 17

23 El equipo también consta de una pantalla conectada al microscopio que encaja perfectamente en el exterior del incubador, gracias a la cual se pueden controlar a los embriones y observar las imágenes tomadas de los mismos sin necesidad de abrir el incubador, manteniendo así mejor las condiciones en el interior. Desarrollado por un equipo de científicos de la Universidad de Stanford (Profesor Renee Reijo Pera, Ph.D. en colaboración con los doctores Dr. Barry Behr, Dr. Thomas Baer, y los becarios postdoctorales Dr. Connie Wong y el Dr. Kevin Loewke) y posteriores fundadores de Auxogyn, organización que llevó a cabo la investigación (Wong y cols. 2010) sobre el desarrollo embrionario que proporcionó el primer vínculo entre el desarrollo en las primeras fases, el tiempo tomado por los embriones para dividirse en cada unos de los ciclos celulares que experimentan y la salud molecular de los mismos. Esta investigación (Wong y cols. 2010), anteriormente mencionada, consistió básicamente en observar un total de 242 embriones congelados en estadio de 2PN en 4 test experimentales diferentes. Estos eran cultivados a lo largo de 6 días, recogiendo a intervalos de 24 horas, una de las placas de cada grupo, las cuales contenían una mezcla de embriones normales ( los que corresponden con el estadio de desarrollo) y anormales (los que no corresponden con el estadio de desarrollo). El análisis genético se hizo tanto del embrión entero como de una de las blastómeras. Imagen 13. Diseño experimental. Tomado de Wong y cols. Non- invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predict development to the blastocyst stage, octubre 2010 Nat Biothech 28,10 18

24 Ya que los parámetros predictivos de imagen están asociados a patrones de transcripción, estos embriones fueron sometidos a una real- time polymerase chain reaction (qrt- PCR) para analizar la expresión de 9 genes relacionados con la citoquinesis para así poner de manifiesto las diferencias de expresión génica entre los embriones normales y los anormales. Se ha visto que divisiones fuera de lo normal se relacionan estrechamente con una reducción en la expresión de estos genes. En la gráfica siguiente se puede ver el ejemplo de un embrión detenido en el estadio de 2 células con citocinesis algo prolongada; éste presenta una expresión menor de los genes comparado con un embrión con desarrollo normal. Imagen 14.Expresión genes citocinésis. Tomado de Wong y cols. Non- invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predict development to the blastocyst stage, octubre 2010 Nat Biothech 28,10 Conjuntamente con estos 9 genes, se analizaron otros 52 adicionales de distinta naturaleza y se vio que los genes involucrados en la citocinesis y en la biogénesis de microrna se expresan en menor grado es estos embriones con desarrollo anormal. En general, estos embriones que no completan su desarrollo muestran una menor expresión de RNA mensajero. Por otro lado, analizaron 141 embriones de los 242 con desarrollo aparentemente normal estableciendo 4 patrones específicos de estadio (ESSP) en la expresión de los genes: ESSP1= mrnas maternos ESSP2=genes embrionarios activos ESSP3=genes que se expresan más en el estadio de blastocito 19

25 ESSP4=transcritos que mantienen estable la expresión de los genes de referencia desde el estadio de zigoto hasta el de blastocito Imagen 15.Expresión ESSP. Tomado de Wong y cols. Non- invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predict development to the blastocyst stage, octubre 2010 Nat Biothech 28,10 Estos resultados ponen de manifiesto que el éxito o fracaso del desarrollo del embrión está determinado desde el primer momento y que posee un alto componente de herencia por parte del ovocito, es decir, hasta la activación del genoma embrionario, aproximadamente hacia el día 3, el embrión no es capaz de fabricar sus propios RNA mensajeros para formar proteínas; en estas primeras etapas tan tempranas del desarrollo, son los transcritos maternos lo que utiliza el embrión para poder desarrollarse, por lo tanto, patrones anormales de expresión alteran el desarrollo del embrión y éste no llegará a alcanzar el estadio de blastocito. (Boiso y cols. 2002; Niakan y cols. 2012) 20

26 Aparte de los análisis genéticos, también se analizaron distintos tiempos dentro de la división celular gracias a la toma de imágenes a intervalos de 5 minutos. De estos tiempos de obtuvieron unos valores medios extraídos de los embriones que alcanzaron el estadio de blastocito: Tiempo de la primera división = 14 ± 6 mins. Intervalo de tiempo entre la primera y la segunda división= 11 ± 2 h Intervalo entre la segunda división y la tercera= 1 ± 1,6 h De un forma más general se puede predecir con un 94% de sensibilidad y un 93% de especificidad que embriones alcanzaran el estadio de blastocito si tienen su primera división entre 0-33 minutos, un tiempo entre la primera y la segunda entre 7,8-14,3 horas y finalmente, un tiempo entre la segunda y la tercera entre 0-5,8 horas. De los distintos embriones analizados, se compararon 4 correspondientes a fenotipos diferentes: (Imagen 16) A B C D Imagen 16.Comparación de fenotipos. Tomado de Wong y cols. Non- invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predict development to the blastocyst stage, octubre 2010 Nat Biothech 28,10 21

27 El embrión de la fila A muestra un desarrollo normal, con un tiempo dentro del intervalo. El de la fila B, morfológicamente es parecido al A pero le lleva mas tiempo alcanzar el estadio de 2 células, aunque igualmente sería considerado embrión normal. En el de la fila C ya se observa a parte de una diferencia en el tiempo que les llevan las divisiones, también en la morfología de las células, dándose mayor número de fragmentos y por último en la fila D, el cual corresponde a un embrión con triploidía, se observa como la división es anormal, ya que su primera división consta en la formación de 3 células y no de 2. Por último, los parámetros obtenidos fueron analizados automáticamente para determinar si realmente sirven para predecir el desarrollo del embrión analizado en D+3 hasta el estadio de blastocito. Esta validación de método se hizo gracias a la creación de un algoritmo de seguimiento automatizado de las divisiones celulares hasta el estadio de 4 células. Básicamente consiste en la comparación de las imágenes obtenidas durante el desarrollo del embrión con las imágenes simuladas de lo que sería un desarrollo óptimo tomando como referencia esos parámetros obtenidos. Fue testado en 14 de los 100 embriones que alcanzaron el estadio de blastocito. Imagen 17.Software de predicción. Tomado de Wong y cols. Non- invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predict development to the blastocyst stage, octubre 2010 Nat Biothech 28,10 La fila de arriba de la imagen 17 corresponde con el desarrollo de uno de los embriones y la de debajo del desarrollo de este embrión, superponiendo las imágenes simuladas. Como se puede apreciar, las diferencias son casi nulas por lo que se puede decir que ciertamente la técnica de análisis puede llegar a predecir en estadio D+3 si el embrión alcanzará el estadio de blasto. 22

28 Tras todos los resultados obtenidos pudieron concluir que el embrión que llega al estadio de blastocito sigue unas pautas de tiempo predecibles y muy estrictas que se pueden comparar con los patrones de expresión génica. Este desarrollo altamente marcado en los embriones de mejor calidad, permite establecer sistemas que puedan medir automáticamente parámetros en la imagen y predecir si el embrión alcanzará el estadio de blastocito. Por último, analizando la expresión genética de estos embriones con un desarrollo correcto se llega a la conclusión de que éste está altamente influenciado por la herencia materna de transcritos, los cuales se observan alterados en embriones anormales. Por lo tanto, la tecnología de EEVA se aprovecha de estos conocimientos para seleccionar el mejor o los mejores embriones candidatos para transferir. Para poner todo lo anterior de manifiesto y gracias a un ensayo clínico presentado en julio de 2012 en la reunión anual de la ESHRE (Estambul, Turquía), llevado a cabo por Auxogyn, en el cual participaron multitud de centros contando con la colaboración de 160 pacientes y un total de 1800 embriones, se llegó a la conclusión de que EEVA es capaz de predecir, con los cálculos efectuados en D+3, si un embrión alcanzará el estadio de blastocito con un 85% de especificidad, reduciendo del un 43% a un 15% los falsos positivos, comparándolo con la clasificación morfológica clásica. Además de esto, también aumenta la coherencia de los resultados de la calidad del embrión cuando son comparados entre embriólogos. 23

29 VENTAJAS - Se adapta a las necesidades de la clínica en cuanto el número de microscopios - Encajan dentro de un incubador estándar INCONVENIENTES - No se utiliza en la clínica, únicamente en investigación - Uso extendido solo a la unión europea - Un microscopio por paciente - Seguimiento continuo del desarrollo del embrión - Predicción en D+3 si el embrión alcanzará el estadio de blastocito con una especificidad del 85% - Reducción falsos positivos de un 43% a un 15% - Su instalación no requerirá un desembolso, se pagaría por resultados obtenidos 24

30 Embryoscope El Embryoscope y sus adjuntos son un conjunto de aparatos, desarrollado por Unisense Fertilitech (Dinamarca), que permite la incubación y observación de 72 embriones de 6 pacientes diferentes. Todo el equipo consta del incubador en si (Embryoscope ), un software que permite evaluar a cada uno de los embriones (EmbryoViewer ) y unas placas de cultivo especiales dentro de las cuales irán colocados los embriones (EmbryoSlide ). A continuación se detalla la función de cada uno de los componentes: - Embryoscope : El Embryoscope es un incubador dentro del cual se incluyen un objetivo de LWD de contraste Hoffman de Leica para visualizar al embrión. Esta observación se hace con luz roja de 635 nm para eliminar la exposición a la luz intensa, que podría dañar al embrión. Gracias a este microscopio se obtienen las imágenes de los embriones, a un intervalo de 20 minutos en diferentes planos, ya que el embrión es un estructura redondeada que ocupa más de un plano de visión, es decir, tiene una conformación en 3D. Gracias a su condición de incubador tri- gas, es capaz de mantener a los embriones en las condiciones óptimas de cultivo a parte de tomar imágenes de ellos continuamente. Es capaz de mantener una concentración de CO2 del 5% con apenas consumo (< 0,5L CO2/h), además la recuperación de la concentración, tanto de CO2 como de O2 es lo mínima posible, estableciendo una recuperación de [CO2] 25

31 Control condiciones cultivo en menos de 5 minutos y de [O2] en no más de 15 minutos. A parte de mantener las concentraciones ideales de gas, posee un control de temperatura único por transferencia de calor directa a cada una de las placas de cultivo, lo cual permite que la pérdida de calor cuando el incubador es abierto sea mínima ( < 0,2 C). Junto con lo anterior, proporciona una circulación continua y purificada (cada 20 minutos) de aire gracias a los filtros HEPA que eliminan el 99,97% de las partículas de menos de 3 microm junto con Whatman Carbon Cap (filtro de carbón activo) que elimina los compuesto volátiles que pudiera haber en el ambiente y que podrían dañar a los embriones. Para finalizar, decir que la incubación se mantiene en seco para evitar una posible contaminación por hongos. Filtros HEPA y Whatman Carbon Cap Lugar de colocación de los embriones Objetivo Hoffman de Leica Teclado - EmbryoViewer : El Embryoviewer es un software que permite trabajar con la información obtenida gracias a la vigilancia continua de los embriones por parte del Embryoscope. Gracias a éste, se puede tanto revisar como anotar y comparar el desarrollo de embriones seleccionando los archivos correspondientes al paciente del interés, permitiendo una evaluación flexible ya que se puede acceder al historial de desarrollo del embrión que se necesite en cualquier momento, pudiendo evaluar un solo embrión a comparar la progresión del desarrollo de un subconjunto de embriones (de la misma paciente). Para esta comparación posee una herramienta de observación de los datos recogidos de cada embrión, pudiendo comparar bloques de tres embriones a la vez pero con una información algo más detallada. 26

32 Cada una de las imágenes (numeradas del 1 al 12) corresponde a un embrión de una placa Aparte de lo dicho anteriormente, este software también permite calcular la actividad celular automáticamente, además de tener los datos recogidos y anotados por los embriólogos en un mismo lugar para futuras revisiones. Igualmente permite la manipulación de la imagen obtenida, es decir, la selección de diferentes planos para observar en detalle estructuras de interés. Junto con esto, también permite la exportación de videos e imágenes y un control de las condiciones de cultivo, como por ejemplo la temperatura o la concentración de CO2. Cálculo de la actividad celular Anotaciones Selección plano Botones para indicar el destino del embrión (transferir, congelar o desechar) 27

33 Gráfica 1.Control de las condiciones de cultivo. Tomado de T.Freour y cols.timr lspdr (Embryoscope ) as a routine technique in the IVF laboratory: A useful tool for better embryo selection?, EmbryoSlide : Son placas especialmente creadas para el cultivo dentro del Embryoscope y compatibles con un microscopio estándar que asegura una identificación de cada embrión gracias a que cada uno de los pocillos de las placas tiene un número fácilmente visible con el microscopio cuando ésta es manipulada. Por otro lado, su diseño permite una manejo fácil y seguro de la placa por parte del personal que además facilita el posicionamiento de los embriones en el fondo de cada pocillo gracias a su estructura cónica; esto permite que el calor llegue mejor al embrión y que se encuentre en las condiciones que aseguran su desarrollo. Gracias a su composición en polímero impermeable al agua también permite que se mantenga un ambiente seco durante todo el cultivo; esto también se ve facilitado por el recubrimiento de los pocillos por aceite mineral, que hace que el medio en el que se encuentran los embriones no pierda humedad. Esta pequeña lengüeta facilita la manipulación de la placa Cada uno de los pocillos contiene un embrión Imagen 18. Placa de cultivo 28

34 Después de esta explicación sobre los distintos componentes del sistema, queda recalcar cuales son esos parámetros de la cinética del desarrollo en los que el Embryoscope se centra para fijar la calidad del embrión: Tiempo exacto de las divisiones o t2 = tiempo de división hasta alcanzar el estadio de 2 células o t3 = tiempo de división hasta alcanzar el estadio de 3 células o t4 = tiempo de división hasta alcanzar el estadio de 4 células o t5 = tiempo de división hasta alcanzar el estadio de 5 células o cc2 = duración del segundo ciclo celular Sincronización de las divisiones o s2 = sincronía en las divisiones desde el estadio de 2 células hasta el de 4 células Historial de fragmentación Aparición del núcleo después de la división Detección de multinucleación en alguna de las blastómeras Los tiempos citados anteriormente han de estar dentro de unos rangos óptimos para que el % de implantación sea mayor. Gracias al estudio de Meseguer y cols. se puso de manifiesto que los embriones fuera de esos rangos tienen una peor capacidad implantatoria. Estos rangos son los siguientes: t2 = 24,3-27,9 horas t3 = 35,4-40,3 horas t5 = 48,8-56,6 horas cc2 11,9 horas s2 0,76 horas (Todas las horas hacen referencia a horas post ICSI) 29

35 Imagen 19. Rangos de tiempo. Modificado de Meseguer y cols The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Hum. Reprod. 26, En estas gráficas se puede apreciar claramente que cuando el embrión se encuentra fuera de ese rango de tiempo, su % de implantación disminuye, atribuyéndole así una peor calidad. Con todo esto, se permite una evaluación de los patrones de desarrollo del embrión, que junto con los parámetro morfológicos clásicos, aumenta la 30

36 posibilidad de embarazo gracias una menor manipulación de los embriones y una selección dentro de los rangos de tiempo estimados para seleccionar los embriones que tienen entre un 10 y un 15% más de posibilidades de implantar que los demás. VENTAJAS - Es a la vez incubador y microscopio(todo integrado en uno) -Tamaño - Pantalla incorporada para el seguimiento de los embriones - Selección de embriones con mayor capacidad de implantar (entre un 10 y un 15%) INCONVENIENTES - Capacidad limitada de embriones (12 embriones/paciente/placa) - Espacio solo para 6 pacientes a la vez - No posee un sistema de análisis automático para predecir el futuro del embrión - Precio - Seguimiento continuo del desarrollo del embrión 31

37 Primo Vision Creado por Vitrolife, la tecnología de Primo Vision se compone de 3 componentes principales, el Primo Vision EVO, Primo Vision Embryo culture dish y el Primo Vision Analizer software. - Primo Vision EVO: Esta es la pieza central, un microscopio compacto digital invertido con un objetivo Hoffman de contraste que permite la observación del desarrollo del embrión. Trabaja con una luz blanca que únicamente se enciende cada 10 minutos un periodo de 3 a 5 segundos (intervalo para sacar imágenes) por lo tanto, tanto la cámara como la luz son apagados automáticamente por una unidad eléctrica de control para que los embriones no se vean expuestos a la luz durante todo el tiempo que están dentro del incubador. Va conectado a una unidad de control por vía USB que permite establecer el intervalo al que se sacan las imágenes. Este microscopio entra dentro de los incubadores normales de un laboratorio de FIV y cada uno de ellos permite la observación de hasta 16 embriones de una sola paciente. Al ser individuales, se pueden instalar tantos como se requieran en cualquier momento. - Primo Vision Embryo culture dish: Es una placa Petri de polietileno (35 mm de diámetro) equipada con la tecnología WOW (Weell of the well) que permite el cultivo de embriones en micropocillos individuales sin perder los beneficios del cultivo en grupo. Estos embriones pueden ser identificados y monitorizados individualmente pero formando parte de la misma placa además, gracias a la profundidad de los micropocillos, se les conferido a los embriones una estabilidad a la hora de la 32

38 manipulación por lo que es más difícil que se escapen del campo de visión del microscopio. Existen dos tamaños, una placa que permite el cultivo simultaneo de 9 embriones y otra hasta 16 embriones a la vez. Micropocillos - Primo Vision Analizer software: Este software sirve para comparar y analizar las imágenes obtenidas gracias a los microscopios del interior del incubador, pero no solo lleva cabo estas dos funciones, si no que también permite un control de calidad continuo de las condiciones dentro del incubador para que estas estén en los valores óptimos. A parte del análisis en el interior del laboratorio también permite un seguimiento fuera de el gracias al acceso remoto el cual permite una valoración online. Esto junto con la aplicación compatible con un Ipad incrementa el manejo de la información obtenida del desarrollo de los embriones en cualquier parte. 33

39 Como los dos sistemas anteriores, Primo- Vision analiza ciertos tiempos dentro del desarrollo embrionario para estimar cual es intervalo apropiado dentro del cual tiene que estar el embrión para considerarlo de buena calidad.(hlinka y cols. 2012; Pribenszky y cols. 2010) En un estudio sobre un caso concreto llevado a cabo por Pribenszky y cols. (2010) de una pareja donde la mujer tenía 37 años de edad con 4 inseminaciones con semen de donante fallidas. Después de estas IAD fallidas se le somete a un proceso de FIV, extrayendo 5 ovocitos a lo que posteriormente se les realizó una ICSI con semen de donante. Una vez realizada la ICSI los embriones se introdujeron en una de las placas WOW y se colocaron en el interior del incubador junto con el microscopio Primo Vision para monitorizar todo su desarrollo. De estos 5 embriones, solo dos alcanzaron el estadio de blastocito expandido, uno el estadio de blastocito y otros dos no lo alcanzaron ya que se detuvieron durante las divisiones tempranas. Por petición de la pareja, se decidió transferir un único embrión, el cual fue seleccionado basándose en el análisis retrospectivos de los tiempos de división y la existencia o no de fragmentación. Tomando en cuenta esos tiempos y % de fragmentación se decidió seleccionar al embrión número 5 gracias a su tiempo de división rápido del estadio de 2 células a 3 células y a la división sincronizada hasta el estadio de 4 células. Tabla 2. Tiempos de división obtenidos. Tomado de Pribenszky y cols. Pregnancy achieved by transfer of a single blastocyst selected by time- lapse monitoring. Reprod Biomed Online 2010;21:

40 La transferencia de este único embrión dio como resultado un embarazo satisfactorio y el nacimiento de un niño sano. A pesar de que este estudio toma un único caso de referencia, sí que se puede afirmar que esta técnica puede ayudar a la elección entre dos embriones que, por el método de clasificación tradicional, serían clasificados por igual pero que gracias al conocimiento del tiempo que el embrión tarda en desarrollarse, se puede tomar una decisión más acertada, afinando la clasificación. Por otro lado, en otro estudio llevado a cabo por Hlinka D. Y cols. (2012) en el que se tomaron 180 embriones que dieron embarazos viables y que habían sido monitorizados con la tecnología del time- lapse (1 imagen/10 minutos). Del desarrollo de estos embriones se recogieron distintos parámetros: Tiempo exacto de las 4 interfases (IP) o IP1= tiempo entre la fertilización y el estadio de 2 células o IP2= tiempo entre el estadio de 2 células y el de 3 células o IP3=tiempo entre el estadio de 4 células y el de 5 células o IP4=tiempo entre el estadio de 8 células y el de 9 células Sincronización de la división entre células hermanas (ID) o ID1= intervalo entre el estadio de zigoto y el de 2 células o ID2= intervalo entre el estadio de 3 células y el de 4 células o ID3= intervalo entre el estadio de 5 células y 8 células o ID4=intervalo entre el estadio de 9 células y 16 células Estos 180 embriones que alcanzaron el estadio de blastocisto, manifestaron unos patrones de tiempo de división muy similares por lo que se puede decir que estos valores de tiempo, estimando un rango, pueden aplicarse como valores de referencia para estimar la calidad del embrión. Se obtuvieron los siguientes rangos para cada parámetro: 35

41 IP Rango ID Rango IP h ID min IP2 10 a 12 h ID2 20 a 60 min IP3 14 a 16 h ID3 120 a 240 min IP4 20 a 26 h ID4 230 a 360 min En este caso, únicamente se tuvo en cuenta los tiempos de división en vez de % de fragmentación y los tiempos como en el caso de Pribenszky y cols. De estos dos estudios, se puede extraer que los parámetros que tiene en cuenta Primo Vision a la hora de evaluar si un embrión es de mejor o de peor calidad, son prácticamente los mismos que en los casos anteriores, por lo tanto, resumidamente los parámetro que evalúa son: Tiempo de formación de los pronúcleos Tiempos de división Sincronización Fragmentación Multinucleación Dinámica del blastocele Parámetros evaluados 36

42 VENTAJAS - El acceso remoto o modo online (aplicación Ipad) - Las placas de cultivo WOW que aporta los beneficios del cultivo en grupo - Encajan dentro de un incubador estándar INCONVENIENTES - Mala calidad de imagen - Exposición del embrión a luz blanca - No posee un sistema de análisis automático para predecir el futuro del embrión - Se adapta a las necesidades de la clínica en relación al volumen de pacientes - Control continuo de las condiciones en el interior del incubador gracias al software y del desarrollo del embrión - El sistema se enciende únicamente cuando se toma la imagen (cada 10 minutos) 37

43 Comparación de los tres sistemas: Tanto el EEVA como el Primo Visión son microscopios pequeños que encajan dentro de los incubadores estándar que posee un laboratorio de reproducción asistida convencional, lo cual les confiere la ventaja de que se puede ajustar a las necesidades de la propia clínica ya que no todas tienen el mismo volumen de trabajo. Por otro lado el Embryoscope tiene condición de incubador con una capacidad limitada debido al espacio del que dispone y por lo tanto menos flexible a la hora de ajustarse a las necesidades pero sí que le da la ventaja de que en este caso un solo microscopio se usa para evaluar a todo el conjunto de pacientes mientras que en lo otros dos sistemas, cada microscopio corresponde a un solo paciente. Por lo general, los tres sistemas se basan en los mismos parámetros morfocinéticos para evaluar la calidad del embrión, moviéndose en rangos de tiempo óptimos de esos parámetros prácticamente iguales por lo que en este aspecto, los tres se comportarían de la misma manera. Una característica añadida que posee el EEVA y que ninguno de los otros dos sistemas posee es ese algoritmo de seguimiento automatizado de las divisiones celulares lo que le permite predecir qué embrión se desarrollará hasta blastocito midiendo distintos parámetros del tamaño celular y de la simetría entre las células, tomando como referencias los datos obtenidos en embriones que han alcanzado esa condición. A la hora del seguimiento de los embriones, una ventaja de que el Embryoscope sea un incubador, es que gracias a su tamaño puede tener incorporada una pantalla por la que observar continuamente. Sí que es verdad que el EEVA está dispuesto de pantalla, pero en este caso acoplada fuera del incubador, lo que requiere algo más de instalación. En el caso de Primo Visión, el análisis se hace desde el ordenador. En lo referente a las placas de cultivo, nuevamente tanto EEVA como Primo Vision se valen del mismo tipo, el cultivo individual en un espacio muy reducido lo cual les confiere las ventajas del cultivo en grupo. En el caso del Embryoscope, cada micropocillo contiene un embrión, privándole de ese beneficioso cultivo. 38

44 Actualmente, solo el Embryoscope y el Primo Vision son utilizados en la clínica, el uso de EEVA es únicamente en investigación, de momento. En resumen, los tres sistemas se basan prácticamente en lo mismo y la elección de uno u otro estará sujeta a los recursos y necesidades de la clínica interesada en adquirirlos, si bien, según mi opinión, el que reúne las características más ventajosas a la hora de su uso en la clínica como método de selección es el Embryoscope gracias a su diseño como incubador. La desventaja que tiene esto es que tiene una capacidad limitada de embriones (12 embriones/paciente/placa) que hace que se tenga que elegir que embriones, dependiendo de las características de la paciente, son colocados en el. Esto se solventa gracias a las numerosas ventajas que posee, como la pantalla incorporada que permite un seguimiento continuo o el control más preciso de las condiciones de cultivo ya que el incubador está especialmente diseñado para restablecer esas condiciones en el caso de apertura del incubador y durante todo el proceso de cultivo. Si que es verdad que requiere un gran desembolso por parte de la clínica ya que posee un precio elevado debido a sus características pero que se solventa gracias a su gran utilidad, que hace que las tasas de embarazo se incrementen, disminuyendo el número de ciclos y por lo tanto el gasto que requieren los ciclos adicionales. 39