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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 kn. de publicación: ES kint. Cl. : C07K 7/08 C07K 7/ A61K 39/21 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Péptidos sintéticos para una vacuna contra HIV-1. k Prioridad: GB 8914 k 73 Titular/es: Connaught Laboratories Limited 17 Steeles Avenue West Willowdale Ontario M2N T8, CA k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Sia, Dwo, Yuan, Charles; Chong, Pele y Klein, Michel k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Gómez-Acebo Pombo, J. Miguel Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 ES T3 DESCRIPCION Campo de la invención La presente invención se relaciona con el diseño y preparación de una vacuna de péptido sintético contra el sindrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) causado por el virus de inmunodeficiencia humana (HIV). En particular, la invención se relaciona con la identificación y caracterización de un epitopo de células T de la proteína de núcleo, p24, de HIV-1, y con metodologías que utilizan este epitopo para construir oligopéptidos inmunogénicos con epitopos de células B autólogos (p24) y varios heterólogos (proteinas de HIV distintas de p24) capaces de inducir una inmunidad eficaz contra HIV. Fundamento de la invención El SIDA es el resultado último de la infección con HIV y en la actualidad no existe curación de la enfermedad, de manera que se requiere urgentemente el desarrollo de una vacuna específica a HIV. Con anterioridad, se ha comprobado que pueden desarrollarse anticuerpos protectores contra una enfermedad específica mediante la administración de componentes también específicos del organismo causante de la enfermedad, antes que todo el organismo haya sido inactivado o atenuado para obtener una raza no patogénica. La proteína de envoltura (gp1) de HIV-1 ha sido empleada como una vacuna candidata contra el SIDA. Si bien se ha demostrado que este inmunógeno, preparado en un vector de vacuna, es capaz de inducir anticuerpos neutralizadores del virus, todos los experimentos realizados con la vacuna fallaron a la hora de proteger primates contra el desafío con aislados de HIV silvestre. Además, se ha demostrado que dos regiones de la proteina gp1, que abarcan a los residuos y 846-8, respectivamente, suprimen la respuesta proliferativa de linfocitos humanos normales a mitógenos en animales inmunizados con estos péptidos conjugados a una proteína de soporte. Esta inmunosupresión mediatizada por péptidos puede jugar un papel importante en la patogénesis de la enfermedad. Estos resultados reforzaron también la necesidad de disponer de un diseño racional para cualquier vacuna sintética contra el SIDA. Para diseñar la mejor vacuna sintética candidata, han de enlazarse muchos epitopos neutralizadores de células B virales inmunogénicas (BE) que contienen un alto grado de secuencia conservada entre aislados virales a determinantes potentes de células estimuladoras T (THD) para ejercer así una respuesta del anticuerpo protectora de cruce fuerte y de larga duración. Igualmente, deberán incluirse epitopos de linfocitos T citotóxicos específicos a HIV (CTL) en las construcciones sintéticas para proporcionar la necesaria inmunidad, mediatizada por células, a la enfermedad por HIV. Puede ser necesario una relación espacial específica y preferencial entre ciertos epitopos de células T y células B para que los epitopos en tandem sean procesados de un modo eficaz y sean inmunogénicos. De este modo, es importante determinar si los epitopos de células T y células B en un diseño propuesto para una vacuna se ensamblan o no en la configuración óptima, de manera que la memoria de ambas células T y B pueda ser desarrollada eficazmente y puedan producirse anticuerpos de la especificidad deseada. Se ha comprobado que el THD no es universal y únicamente es funcional inmunológicamente cuando se presenta en asociación con los antígenos de clase II de complejos de histocompatibilidad principal (MHC) adecuados. Existe una gerarquia característica del dominio de epitopos de células T. Por tanto, para desarrollar una vacuna sintética contra el SIDA, es importante identificar el THD más potente de los diversos genes gp1, gag, pol y de otros productos genéticos de HIV. Ha podido caracterizarse completamente un número de THD y BE de la proteina gp1 y aunque se han pronosticado, mediante algoritmos standard, los epitopos B y T de proteinas gag y pol, la estructura de estos epitopos no ha sido todavía determinada experimentalmente. Estudios recientes han indicado que los productos genéticos de gag pueden jugar un papel crucial a la hora de ejercer una respuesta inmune contra una infección por HIV. De este modo, la progresión clínica del SIDA está asociada con una reducción de anticuerpos circulatorios a la proteína p24 de gag y los anticuerpos promovidos contra un péptido p17 inmunodominante de gag son capaces de inhibir in vitro la infección por HIV-1. Por otro lado, se ha comprobado que el THD de núcleo del virus de hepatitis B es más eficaz que el THD de la envoltura a la hora de auxiliar la inducción de la respuesta del anticuerpo al antigeno de superficie S. Por analogía con el sistema viral de hepatitis B, fué de interés identificar un potente gag-thd en HIV. Mediante el uso de algoritmos pronosticadores de la estructura convencionales para epitopos de células T y células B, hemos podido identificar y sintetizar químicamente un panel de péptidos gag potencialmente inmunogénicos (Tabla I) y se han estudiado extensivamente las propiedades inmunológicas de uno de ellos, p24e. La Patente Europea publicada describe la identificación de péptidos cortos de proteínas del virus del SIDA que ejercen inmunidad de células T. La referencia describe que se pronostican ciertos segmentos de la región gag del genoma de HIV como candidatos para puntos de estimulación de células T, incluyendo el identificado como el segmento No existe descripción alguna de la síntesis de 2

3 ES T3 este segmento ni tampoco confirmación alguna de las propiedades inmunológicas. La Patente Europea publicada describe secuencias péptidas que imitan inmunológicamente a proteinas codificadas por las regiones eny yenyde LAV -2. Un péptido derivado de la región gag de LAV-2 es designado como y se identifica como comprendiendo residuos 274 a 316 y la Figura 2 muestra la secuencia para HIV-1. El péptido es sintetizado y se demuestran propiedades de ligación de anticuerpos. Sin embargo, ninguna de las referencias reconoce el potencial de combinar epitopos de células T y células B de HIV-1 en una vacuna candidata contra HIV -1. Resumen de la invención 1 2 De acuerdo con un aspecto de la presente invención, los inventores han encontrado un potente inmunógeno sintético de HIV-1 (HIV-1 p24) que comprende epitopos de células T y B en tandem gag-p24. Razas de ratones consanguíneos cebadas con el péptido libre HIV-1 -p24 en adyuvante completo de Freund y reforzadas con el mismo péptido en adyuvante incompleto de Freund, ejercieron una fuerte respuesta secundaria del anticuerpo p24 anti-hiv-1, tal y como se juzgó mediante un inmunoanálisis enzimático específico al péptido (EIA). Los anticuerpos anti-péptidos reconocieron la proteina viral p24 en inmunotransferencia. Además, se comprobó que el péptido, presentado en el contexto MHC adecuado, era altamente estimulador para las líneas de células T murinicas específicas a p24. Losinventoreshandemostradotambién que el epitopo de células T de HIV-1-p24, p24e, puede mediatizar una respuesta de anticuerpo a determinantes heterólogos de células B (determinantes de la envoltura de células B, por ejemplo) y construyeron varios oligopéptidos p24/gp1 quiméricos inmunogénicos capaces de inducir una respuesta de anticuerpo anti-envoltura. Los inventores han demostrado además que la polaridad de los epitopos de células T y B afecta a la inmunogenicidad de los péptidos quiméricos y que la incorporación de un enlazador entre los dos epitopos puede modular la inmunogenicidad de los péptidos. Breve descripción del dibujo La Figura 1 es una representación esquemática de la estructura de la proteina p24e. Descripción de la invención Recientemente se han propuesto dos modelos para la predicción de determinantes antigénicos de células T en base a la secuencia primaria. Se ha propuesto (ref 1.) que los epitopos de células T implican probablemente secuencias proteínicas que tienen un potencial para adoptar configuraciones anfapáticas estables de hélice a, de manera que residuos hidrófilos están situados en uno de los lados de la hélice y residuos hidrófobos se encuentran en el otro lado. Independientemente, se ha observado que se presenta frecuentemente un modelo de secuencia primaria en puntos antigénicos de células T. Este motivo de ligación de células T consiste normalmente en un residuo cargado o una glicina, seguido por dos o tres residuos hidrófobos, seguido por un residuo hidrófilo (ref 2.). La posición de los epitopos de células T potenciales de la proteina p24 de HIV-1 ha sido pronosticada por algoritmos estructurales (Tabla 1). La secuencia GPKEPFRDYVDRFYK, de uno de los epitopos pronosticados p24 de células T, p24e, se conserva en una medida muy elevada en las diversas razas de HIV-1 que han sido aisladas y probablemente tiene una estructura anfipática de hélice a como se ilustra en la Figura 1. Los resultados del experimento de proliferación in vitro que demuestran que p24e contiene realmente un epitopo de células T, quedan recogidos en la Tabla 2. Se comprobó quelalínea de células T murínicas, específicas a p24, Tp241, únicamente respondia al péptido sintético,p24e,pero no a cualquiera de los péptidos TE1E o TB8 que contienen individualmente una secuencia parcial de p24e. La función soporte de células T exhibida por p24e se demostró estudiando la inmunogenicidad de un oligopéptido no conjugado p24e que abarca a HIV-1-p24 (residuos 292-6) y de un epitopo pronosticado p24 de células B, B (residuos 7-316), de la proteína de gag, p24. Los péptidos HIV-1-p24 y B p24 fueron inyectados por separado en cantidades cada vez mayores en adyuvante completo de Freund en razas de ratones consaguineos de diferentes haplotipos de complejo de histocompatibilidad principal 3

4 ES T3 (MHC). Los ratones fueron reforzados 3 semanas después con la mitad de la cantidad original de péptido en adyuvante incompleto de Freund. Se recogieron sueros 9 días después del desafio y se analizaron respecto a la presencia de anticuerpos de IgG específicos a los péptidos Los resultados del inmunoanálisis enzimático, resumidos en la Tabla 3, indican que el péptido libre p24 B no fué inmunogénico en las tres dosis inmunizantes (4, y 0 µg) ensayadas. Sin embargo, este epitopo de células B llegó a ser inmunogénico cuando se enlazó al terminal C de p24e (péptido HIV-1- p24). Se detectaron altos títulos de IgG anti-hiv-1-p24 en los sueros de ratones inmunizados de 4 de las razas consanguineas, especialmente Bal/c (H-2d), SWR/J (H-2g), C3H (H-2k) y C7BL/6 (H-2b). Los ratones C7BL/6 y Balb/c aparecieron como los de mejor respuesta tal y como se juzgó por sus altos títulos de IgG en suero anti-péptido ( y 4.000, respectivamente), mientras que las razas SWR/J y C3H con títulos anti-hiv-1-p24 de 1 en 1.0 y la raza SJL/J con un título de 1 en fueron de una respuesta intermedia y pobre al péptido, respectivamente. Se comprobó que la inmunogenicidad del epitopo de células B depende de la polaridad de los péptidos B y p24e. El oligopéptido en el cual el epitopo de células B, B está enlazado al terminal N de p24e, fué incapaz de inducir una respuesta de anticuerpo contra su determinante de células B (Tabla 3). La especificidad de los anticuerpos de IgG anti-hiv-1-p24 se demostró comprobando que un antisuero anti-hiv-1-p24 de Balb/c (H-2d) reaccionaba exclusivamente contra p24 y no contra otras proteinas virales, en EIA s utilizando cualquiera de p24 o gp41 (DuPont) o gp1 (Repli.gen Corp.) recombinantes como antígenos objetivo. El mismo antisuero reconoció también específicamente la proteina viral p24 en inmunotransferencia usando tiras de inmunotransferencia Western de HIV-1 comerciales Pan.Data Systems, Bio Rad). Estos resultados, por tanto, demuestran que p24e es un potente epitopo T-estimulador (Th) capaz de proporcionar ayuda inmunológica para inducir la generación de respuestas de anticuerpos contra epitopos autólogos p24 de células B en ausencia de una proteína de soporte foránea. Con el fín de investigar si el epitopo T -estimulador (Th), p24e, podría mediatizar también una respuesta de anticuerpo contra determinantes heterólogos de células B, se sintetizó un oligopéptido quimérico, p24e-be3, que contiene una secuencia de epitopos no inmunogénicos de células B BE3, acompañando a residuos aminoácido (LPTPRGPNRPEGIEEEGGERDRDRS) de la proteína de envoltura gp16o de HIV-1 (ref. 3) enlazada en tandem al terminal C de p24e. Las razas de ratones consanguineos (Balb/c, SJL/J, A/J, C3H y C7BL/6) inmunizadas con el péptido quimérico libre siguiendo el protocolo usado para la inmunización con el péptido HIV-1-p24, fueron capaces de generar una respuesta de anticuerpo secundaria antienvoltura (BE3) como queda demostrado en la Tabla 4. Los mayores títulos de IgG en suero anti-be3 (1 en 1.0) se obtuvieron en las razas de ratones Balb/c y C7BL/6 inmunizadas con 0 µg de péptido p24e-be3, sugiriendo ello que estos dos haplotipos son los de mejor respuesta al péptido quimérico. Introdujimos una secuencia separadora entre los epitopos de células T y células B para modular la inmunogenicidad de un péptido quimérico, BE3-p24E. Al contrario que en p24e-be3, la secuencia BE3 del péptido BE3-p24E está situada en el terminal N de p24e. Este péptido BE3-p24E no fué inmunogénico en las razas de ratones consanguíneos ensayadas (Tabla ). Por el contrario, el péptido quimérico, BE3- PP-p24E, en el cual se han insertado dos residuos prolinea (PP) entre los epitopos de células T y células B, fué inmunogénico y capaz de inducir producción de anticuerpos anti-be3 en las razas de ratones consanguíneos ensayadas (SJL/J, A/J, C7BL/6, Balb/c Y C3H). Los resultados anteriores, tomados colectivamente, sugieren que el aumento de la inmunogenicidad de BE3 usando p24e como un soporte de células T depende de la polaridad de los epitopos. La forma no inmunogénica de la construcción sintética, BE3 -p24e, puede hacerse inmunogénica insertando un enlazador, tal como prolina-prolina, entre los epitopos. El péptido p24e se utilizó también para aumentar la inmunogenicidad de otros epitopos heterólogos de células B. Los péptidos quiméricos, ENV-PP-p24E y p24e-pp-env, fueron sintetizados usando otro epitopo de células B de HIV-1, ENV, que abarcan los residuos aminoácido (GIRPVVSTQLLN- GSLAE) de la proteína de envoltura gp1 (ref. 4) enlazada en tandem a cualquiera de los terminales N o C de p24e, respectivamente, por vía de un enlazador prolina-prolina. Se encontró que la construcción p24e-pp-env era inmunogénica en las razas consanguíneas examinadas tal y como se juzgó por la respuesta humoral contra el péptido ENV (Tabla 6). Por el contrario, ENV-PP-p24E fué inmunogénico únicamente en 3 de las razas. Estos resultados confirman que la polaridad de los epitopos de células B y T resulta crítica a la hora de determinar la inmunogenicidad de péptidos quiméricos. 4

5 ES T3 La función de soporte del péptido p24e fué evaluada adicionalmente estudiando la inmunogenicidad de otro péptido quimérico, V3A-PP-p24E. La secuencia NTRKSIRIQRGPGRAFVTIG de V3A (residuos 8-327) del bucle variable de gp1 de HIV-L, que contiene un epitopo neutralizante principal de células B (ref. ), no es inmunogénica en ratones consanguíneos (Tabla 7). El péptido V3A se hizo inmunogénico enlazándolo al terminal N de p24e por vía del enlazador prolina-prolina. El título más elevado de IgG del péptido anti-v3a se midió en sueros de ratones STL/J inmunizados con V3A-PP-p24E. La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos Ejemplos Los métodos de síntesis de péptidos, inmunoanálisis enzimáticos (EIA) y otros procedimientos de ensayos inmunológicos que no son descritos de manera explicita en esta descripción y ejemplos adjuntos, se encuentran ampliamente descritos en la bibliografía científica y se encuentran dentro del alcance del conocimiento de los expertos en la materia. Ejemplo I Este Ejemplo ilustra la síntesis de péptidos. Los oligopéptidos mostrados en la Tabla I fueron sintetizados según la secuencia de aminoácidos ofrecida para el aislado de HIV/LAV usando el sintetizador de péptidos ABI (Aplied Biosystems Inc) 4A. Se siguió elprotocolodesíntesis en fase sólidaenlaforma descrita por el fabricante excepto que la adición de histidina se efectuó mediante doble acoplamiento. Los péptidos en bruto fueron separados de la resina mediante tratamiento con ácido fluorhídrico en presencia de anisol, tiocresol y dimetilsulfóxido, seguido por precipitación con éter dietílico. Los péptidos fueron purificados por cromatografía en fase líquida en fase inversa de alto rendimiento (RP-HPLC) utilizando una columna Vydac C4 y un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoracético al 0,1%. Los análisis de aminoácidos revelaron que las composiciones de aminoácidos de los péptidos purificados individuales eran correctas. Ejemplo II Este Ejemplo ilustra el método usado para demostrar que el péptido p24e es un epitopo funcional de células T. Se generaron líneas de células T murínicas, específicas al péptido HIVI-p24, de acuerdo con un método similaral descrito por Sia (ref. 6). Se utilizó una concentración óptima del péptido HIV-1-p24 (0 µg/ml) para propagar las líneas de células T de Balb/c específicas al antígeno, en presencia de interleucina-2 recombinante ( µ/ml). La capacidad del péptido p24e presentado por esplenocitos singénicos para inducir la proliferación de las líneas de células T in vitro, tal y como fué evaluada por un ensayo standard de absorción de timidina tritiada, demostró claramente que p24e contenía un epitopo funcional de células T (Tabla 2). Por otro lado, la inmunización de ratones Balb/c con el péptido libre p24e emulsionado en adyuvante de Freund no ejerció una respuesta de anticuerpo anti-p24e. Ejemplo III 4 0 Este Ejemplo describe el protocolo usado para ensayar la inmunogenicidad del péptido HIV-1-p24 y oligopéptidos quiméricos. En los estudios de inmunogenicidad se utilizaron razas de ratones consanguíneos de diferentes haplotipos MHC, especialmente Balb/c, (H-2d), SJL/J (H -2s), A/J (H-2a), C3H (H-2k) y C7BL/6 (H- 2b). Se inmunizaron 4 ratones de cada raza con 4, o 0 µg del oligopóptido libre, como sigue. Los animales recibieron la dosis indicada del péptido en adyuvante completo de Freund (CFA) por vía subcutánea, a continuación se suministró una dosis de desafio de la mitad de la cantidad del mismo péptido emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA) 3 semanas más tarde. Los sueros de los animales experimentales recogidos en el noveno día después del desafio, fueron analizados respecto a anticuerpos de IgG específicos al péptido, usando un EIA standard. Ejemplo IV Este Ejemplo ilustra el ensayo de anticuerpos anti-péptidos usando un inmunoanálisis enzimático (EIA). El EIA para la detección de anticuerpos anti -HIV-1-p24 se realizó revistiendo placas de EIA (Ma-

6 ES T3 1 2 xisorp, NUNC, Denmarck) con HIV-1-p24 en salina tamponada con fosfato (PBS, ph 7,0) a 1 pg por pocillo. Se dejó que tuviera lugar la absorción del péptido durante la noche a 4 C. La solución péptida fué aspirada de los pocillos y las placas se bloquearon por la adición de 0 µl de 2% (p/v) de leche desnatada (Carnation, U.K.) por pocillo. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, el péptido no ligado fué separado mediante lavado de las placas tres veces con tampón de lavado [PBS, ph 7,0, conteniendo 0,02% Tween (Bio-rad Laboratories, Richmond, CA)]. Se realizó entonces una dilución a 3 veces de cada una de las muestras de suero experimentales comenzando la primera en 0 en PBS conteniendo 0,1% de leche desnatada, y luego se añadieron 0 µl del suero diluido a cada una de los pocillos revestidos con péptido. Cada dilución de las muestras de suero se analizó por duplicado. La ligación de los anticuerpos anti-hiv-1-p24 del suero al péptido inmovilizado se dejó quetuvieralugar por incubación de las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos no ligados fueron separados mediante lavado de las placas 3 veces con tampón de lavado. Para detectar la ligación específica de IgG anti-hiv-1-p24 al péptido objetivo, se añadieron entonces a cada uno de los pocillos 0 µl de anticuerpo IgG de cabra anti-ratón conjugado a peroxidasa de rábano picante (Jackson Lab.) diluido 1 en.000 en tampón de lavado tal y como recomienda el fabricante. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, el conjugado de anticuerpo no ligado se separó mediante lavado de las placas 4 veces con el tampón de lavado. La cantidad de conjugado ligado se analizó por adición de 0 µl de una mezcla de tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno (una parte de TMB por 9 partes de peróxido de hidrógeno). Se dejó que tuviera lugar el desarrollo de color a temperatura ambiente en la oscuridad durante -1 minutos y luego se detuvo por la adición de 0 µl de ácido sulfúrico 1N. Las densidades ópticas de las reacciones enzimáticas fueron leidas en un espectrofotómetro Titertek Multi Skan (modelo MCC/3) a nm. Los resultados se ofrecen en la Tabla 3 y se expresan como títulos recíprocos medios. Los títulos recíprocos para sueros normales de ratón, independientemente de los haplotipos, fueron siempre inferiores a 0. Ejemplo V Este Ejemplo ilustra adicionalmente la detección de anticuerpos anti-péptido de envoltura de HIV Los anticuerpos anti-péptido de envoltura fueron detectados en un EIA similar al descrito anteriormente, pero con las siguientes modificaciones. Se revistieron placas de EIA con estreptavidina en PBS en una proporción de 3 µg por pocillo. Una vez que las placas fueron bloqueadas con 2% de leche desnatada, se añadieron entonces 0,1 µg delpéptido de envoltura biotinilado (BE3, ENV o V3A) a cada uno de los pocillos revestidos con estreptavidina. Se dejó que tuviera lugar la ligación del péptido biotinilado a la estreptavidina durante 2 horas a temperatura ambiente. El péptido no ligado fué separado mediante lavado de las placas tres veces con el tampón de lavado (PBS, ph 7,0, conteniendo 0,2% Tween ). La actividad anti-igg de envoltura fué analizada también añadiendo 0 µl de los sueros experimentales diluidos en serie en PBS conteniendo 1% de leche desnatada, en cada uno de los pocillos revestidos con péptido biotinilado ligado a estreptavidina. La ligación de los anticuerpos anti-envoltura se detectó entonces utilizando un anticuerpo de cabra anti-igg de ratón purificado por afinidad y conjugado a peroxidasa de rábano picante como se ha descrito en el Ejemplo IV. Los resultados se ofrecen en las Tablas 4,, 6 y 7. Ejemplo VI Este Ejemplo ilustra la biotinilación de péptidos. Se añadieron 0 µl de una solución de NHS -biotina ( mg de NHS-biotina en 1 ml de dimetilformamida [DMF] ) y 0,2 ml de bicarbonato sódico1ma1mgdepéptido disuelto en 2 ml de DMF o de hidrocloruro de guanidina 6 M en PBS, ph 7,. Se dejaron reaccionar los péptidos con NHS-biotina durante 2-6 horas a temperatura ambiente. Después de la modificación, los péptidos biotinilados fueron purificados por HPLC de fase inversa o por cromatografía de filtración de gel. Ejemplo VII Este Ejemplo ilustra el uso del epitopo de células T, p24e, como un péptido de soporte de células T. Los estudios de inmunogenicidad demostraron que las razas de ratones consanguíneos (Balb/c, SJL/J, A/J, C3H y C7BL/6) inmunizados con el péptido quimérico sin conjugar, p24e-be3, usando el protocolo descrito para el péptido HIV-1-p24 en el Ejemplo III, resultaron ser capaces de generar una respuesta secundaria de anticuerpo anti-péptido de envoltura (anti-be3) (Tabla 4). 6

7 ES T3 Ejemplo VIII 1 Este Ejemplo ilustra el uso de un enlazador prolina-prolina para modular la inmunogenicidad de péptidos quiméricos. Se efectuó un experimento de inmunogenicidad simular al descrito en el Ejemplo III con los péptidos BE3-p24E y BE3-PP-p24E los cuales contenian dos residuos prolina entre los epitopos de células T y células B. Los anticuerpos anti-be3 se midieron mediante EIA usando BE3 biotinilado como antígeno objetivo. Los resultados se ofrecen en la Tabla. Ejemplo IX Este Ejemplo ilustra el uso de p24e como soporte de células T para otros epitopos heterólogos de células B. Se llevó a cabo un experimento de inmunogenicidad similar al del Ejemplo III con los péptidos quiméricos ENV-PP-p24E, p24e-pp-env y V3A-PP-p24E. Los resultados se ofrecen en las Tablas 6 y 7, respectivamente. Ejemplo X Este Ejemplo ilustra el uso de la técnica de inmunotransferencia. 2 Se ensayaron anticuerpos promovidos en ratones contra los péptidos sintéticos respecto a su inmunoespecificidad usando la técnica de inmune-transferencia. Las proteinas virales de HIV-1, inmovilizadas sobre tiras de nitrocelulosa, fueron adquiridas en Pan Data System Inc. y Bio-rad y la inmunotransferencia se efectuó de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los sueros de los ratones fueron analizados a una dilución de 1 en 0. Referencias: 1. Delisi y Bersofsky, P.N.A.S., 82, 7048, (198) 3 2. Rothbard y Taylor, EMBO, 7, 93, (1988) 3. Kennedy et al., Science, 231, 6, (1986) 4. Ho et al., Science, 239, 21, (1988). Matsushita et al., J. Virology, 62(6), 27, (1988) 6. Sia et al., Immunology, 1, 7, (1984) 4 TABLA I Epitopos de células T pronosticados en los productos genéticos Gag de HIV-1 0 Producto Nombre Homología genético del de de Gag péptido Secuencia razas p17 p17a EELRSLYNTVAT 92% p17b DTKEALDKIEEEQNKSKKKA 80% 7

8 ES T3 TABLA I (Cont.) Epitopos de células T pronosticados en los productos genéticos Gag de HIV-1 Producto Nombre Homología genético del de de Gag péptido Secuencia razas 1 p24 p24a ARTLNAWVKVVEEKAFSPEVIP 8% p24b LKETINEEAAEWDRVHPVHAG 80% p24c GQLREPRGSDIAGTTSTLQEQI 90% p24d IPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSP 80% p24e GPKEPFRDYVDRFYK 8% HIV1-p24 p24e TLRAEQASQEV 80% p24f LEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEA 9% p24g TETLLVQNANPDCKTILKALGPAA 8% p1 p1a ARNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDC 80% 2 TABLA 2 Respuesta proliferativa de la línea Tp241 de células T específica a Balb/c p24 a péptidos sintéticos de HIV Antígeno Secuencia Proliferación [absorción de 3 H-Tdr], recuentos por min. 0 µg µg 4 µg 0,8 µg 3 4 p ± ± ± ±771 p24e (p24) GPKEPFRDYVDRFYK (292-6).216± ± ±32 712±81 TE1E (p24) GPKEPFRDY (292-0) 412±47 428±32 311±7 386±41 TB8 (p24) DRFYKTLR (2-9) 9±79 416±4 363± 261±24 BE3 (gp1) LPTPRGPDRPEG- IEEEGGERDRDRS (727-71) 426±48 368±44 264±23 296±2 Control 248±21 Con A (µ %g/ml) ±

9 ES T3 TABLA 3 Estudios de inmunogenicidad comparativa de los péptidos HIV-1-p24 y B-24E 1 Título recíproco anti-igg de HIV-p Dosis Razade Haplo µg µg µg ratón tipo B HIV-1-p24E B-p24E B HIV-1-p24E B-24E B HIV-1-p24E B-p24E Balb/c d < <0 < <0 < SJL/J s <0 0 <0 <0 0 <0 <0 0 SWR/J q <0 <0 <0 <0 0 <0 <0 1.0 <0 C3H k <0 <0 <0 <0 0 <0 < C7BL/J b < <0 < < TABLA 4 Respuesta de anticuerpo al péptido p24e-be3 2 Título recíproco anti-igg de péptido BE Dosis Raza ratón Haplotipo 4 µg µg 0 µg 3 Balb/c d SJL/J <0 0 0 A/J a <0 <0 0 C3H k C7BL/6 b TABLA Estudios sobre péptidos quiméricos BE3-p24E y BE3-PP-p24E 4 Título recíproco anti-igg de péptido BE Anti-BE3-p24E Anti-BE3-PP-p24E Raza ratón 4 µg µg 0 µg 4 µg 2µg 0 µg 0 Balb/c <0 <0 <0 c) SJL/J <0 <0 < A/J <0 <0 < C3H <0 <0 < C7BL/6 <0 <0 <0 <0 <0 00 9

10 ES T3 TABLA 6 Respuestadeanticuerpoalospéptidos quiméricos ENV-PP -24E y p24e-pp-env Título recíproco anti-igg de péptido ENV ENV-PP-p24E p24e-pp-env Raza ratón 4 µg µg 0 µg 4µ µg 0 µg 1 Balb/c ND <0 0 c) <0 0 0 SJL/J ND <0 <0 0 A/J ND <0 <0 <0 <0 800 C3H ND <0 <0 <0 0 0 C7BL/6 ND TABLA 7 Inmunogenicidad de los oligopéptidos V3A y V3A-PP-p24E 2 Título recíproco anti-igg de péptido V3A -----Dosis----- Raza ratón µg 0 µg V3A V3A-PP-p24E V3A V3A-PP-D24E 3 SJL/J <0 800 <0 800 SWR/J <0 0 <0 0 A/J <0 0 <

11 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Un proceso para la producción de un péptido quimérico sintético, caracterizado porque comprende formar un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un epitopo de células T de la proteina gag de HIV-1 enlazada a la secuencia de aminoácidos de un epitopo de células B de una proteína de HIV. 2. Un proceso para la producción de un péptido quimérico sintético, caracterizado porque comprende formar un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos del epitopo de células T de la proteina gag de HIV-1; formar un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos del epitopo de células B de una proteína de envoltura o de núcleo de HIV-1; y enlazar entonces dichos dos péptidos entre sí. 3. Un proceso según la reivindicación 1 ó 2,caracterizado porque el epitopo de células T es p24e (residuos 292 a 6) o HIVI-p Un proceso según la reivindicación 3, caracterizado porque el epitopo de células B es un epitopo de células B de la proteína de núcleo enlazada al terminal C del epitopo de células B de la proteina gag enlazada al terminal C de la proteina p24e.. Un proceso según la reivindicación 3, caracterizado porque el epitopo de células B es la secuencia de BE3 que abarca los residuos aminoácido 727 a 71 de la proteína de envoltura de HIV-1 unida al terminal C de la proteina p24e por una secuencia enlazadora. 6. Un proceso según la reivindicación 3, caracterizado porque el epitopo de células B es un epitopo de células B enlazado al terminal C o N de la proteina p24e mediante una secuencia enlazadora. 7. Un proceso según la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia enlazadora es PP. 8. Un proceso según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho epitopo de células B comprende BE3 conectado al terminal N de la proteina p24e. 9. Un proceso según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho epitopo de células B comprende la secuencia de ENV que abarca los residuos aminoácido 26 a 273 de la proteína de núcleo de envoltura de HIV-1.. Un proceso según la reivindicación 7, caracterizado porque el epitopo de células B comprende la secuencia de V3A que abarca los residuos aminoácido 8 a 327 del bucle variable de proteina gp1 de HIV-1 conectada al terminal N de la proteina p24e. 11. Un proceso para la producción de una vacuna contra HIV-1, caracterizado porque comprende producir una proteina o péptido inmunogénica sintética que sirve como componente activo de la vacuna, comprendiendo dicha proteina o péptido sintética la secuencia de aminoácidos de un epitopo de células T de la proteina gag de HIV-1 enlazada a una proteína o péptido sintética correspondiente a un epitopo de células B de una proteína de HIV Un proceso según la reivindicación 11, caracterizado porque el epitopo de células T es proteína p24e o proteina HIV-1-p Un proceso según la reivindicación 11, caracterizado porque el epitopo de células B es la proteina BE3, ENV o V3A. 14. Un proceso según la reivindicación 13, caracterizado porque el epitopo de células B está unido al terminal C de la proteina gag. 1. Un proceso según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque el epitopo de células B está unido al terminal C mediante una secuencia enlazadora. 11

12 ES T3 16. Un proceso según la reivindicación 11, caracterizado porque el epitopo de células B es la proteina BE3, ENV o V3A unida a la proteina gag mediante una secuencia enlazadora que comprende PP NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 12

13 ES T3 13