Tema 2. La preparación de la muestra

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1 Tema 2. La preparación de la muestra F. Javier Señoráns Rodríguez Sección Departamental de Ciencias de la Alimentación M - 08 despacho javier.senorans@uam.es Página web: Asignatura de Grado en Nutrición Humana y Dietética Tema 2. La preparación de la muestra Aislamiento y concentración de compuestos en alimentos. Técnicas de muestreo de la fase vapor: el análisis del espacio de cabeza (método estático y método dinámico). Técnicas actuales de concentración del espacio de cabeza. La microextracción en fase sólida (SPME). La extracción en fase sólida (SPE). La extracción supercrítica analítica (SFE). La extracción acelerada con disolventes (ASE). La extracción asistida por microondas (MAE). Aplicaciones al análisis del aroma de alimentos y al análisis de residuos. Grado en Nutrición Humana y Dietética 1

2 Nuevas técnicas de preparación de la muestra La mayoría de las muestras de alimentos que se analizan por métodos instrumentales de separación son demasiado complejas, están demasiado diluidas o son incompatibles con el sistema cromatográfico, lo que impide su introducción directa Consecuencia: se necesita preparar la muestra antes de su introducción en el sistema, mediante fraccionamiento, extracción o pre-separación. Nuevas técnicas de preparación de la muestra CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNAS CAPILARES ALTA RESOLUCIÓN PROBLEMA PREPARACIÓN DE MUESTRA MUESTRA GC MUESTRA PREPARACIÓN DE MUESTRA GC Grado en Nutrición Humana y Dietética 2

3 Necesidad de nuevas técnicas de preparación de muestras de alimentos Problemas actuales de métodos oficiales y tradicionales: lentitud y laboriosidad empleo de grandes cantidades de disolventes tóxicos poca selectividad poco rendimiento Métodos tradicionales de preparación de la muestra: -más de 2/3 del tiempo del analista -responsable de al menos 1/3 del error en el análisis -enorme volumen de disolventes Necesidad de nuevas técnicas de preparación de muestras de alimentos Creciente demanda de : mayor productividad en los laboratorios análisis más rápidos métodos más automatizados Metas posibilidad de automatización técnicas limpias y selectivas mayor rapidez y eficacia fiabilidad Idealmente, además, baratas, sencillas, sin disolventes tóxicos Grado en Nutrición Humana y Dietética 3

4 Técnicas instrumentales de preparación de muestras de alimentos Posibilidades clásicas: Cristalización Destilación Precipitación Extracción con disolventes Otras: LLE, Soxhlet, etc. Diálisis y microdiálisis Filtración Ultrafiltración Separaciones con membranas Técnicas instrumentales de preparación de muestras de alimentos Técnicas basadas en la cromatografía: Cromatografía en capa fina (TLC) Cromatografía en columnas abiertas (flash) LC prep. cromatografía preparativa Acoplamiento LC-GC SFC preparativa Grado en Nutrición Humana y Dietética 4

5 Técnicas instrumentales de preparación de muestras de alimentos Técnicas basadas en la extracción Extracción Sólido-liquido Extracción Líquido-líquido Extracciones modernas (ASE, MAE, SFE, etc.) SPE, SPME, etc. Fundamentos de la Cromatografía en capa fina (TLC, Thin Layer Chromatography) Fundamento La cromatografía en capa fina al igual que otras técnicas cromatográficas se basa en la retención y elución debido a la diferente interacción del analito entre una fase sólida y otra líquida. La placa se introduce en un recipiente que contiene la fase móvil y alineada con una tira de papel adsorbente. El disolvente asciende por capilaridad y la separación se basa en la diferente velocidad a la que los distintos analitos presentes en la muestra ascienden por la placa. Grado en Nutrición Humana y Dietética 5

6 Fundamentos de la Cromatografía en capa fina Cálculo de los Factores de Retención (RF) Para ello se emplea la siguiente formula DA RF = DS Frente del disolvente Posición del analito tras la cromatografía origen siendo DA la distancia recorrida por el analito y DS la distancia recorrida por el disolvente o frente del disolvente. Cromatografía en columna Fundamento La cromatografía en columna al igual que otras técnicas cromatográficas se basa en la retención y elución debido a la diferente interacción del analito entre una fase sólida que rellena una columna abierta y otra líquida (normalmente un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes). Grado en Nutrición Humana y Dietética 6

7 Esquema Tema 2. La preparación de la muestra Introducción a las técnicas de preparación de muestra Extracción sólido-líquido Extracción líquido-líquido Cromatografía en capa fina y cromatografía en columna Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME, Solid Phase Micro-Extraction) Extracción Asistida por Microondas (MAE, Microwave Assisted Extraction) Extracción Acelerada con Disolventes (ASE, Accelerated Solvent Extraction) Extracción en Fase Sólida (SPE, Solid Phase Extraction) Diferentes técnicas para problemas distintos Aroma y compuestos volátiles de alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc Espacio de cabeza SPME Componentes naturales o contaminantes de alimentos líquidos: zumos y bebidas, aceites, leche, etc. Muestras sólidas de alimentos: Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos (ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles) Residuos y contaminantes en alimentos Extracción en fase sólida MAE ASE SFE Grado en Nutrición Humana y Dietética 7

8 Determinación de compuestos volátiles en muestras de alimentos Cromatografía de gases Problemas: Técnicas de aislamiento y concentración de compuestos volátiles de la matriz trazas aislamiento compuestos volátiles del alimento o del producto a analizar se requieren grandes cantidades de producto para obtener la adecuada cantidad para análisis por CG o CG-EM Técnicas de aislamiento y concentración de compuestos volátiles de la matriz Nuevas técnicas basadas en el análisis del espacio de cabeza - se basan en la preconcentración, para posterior análisis y determinación, de los compuestos volátiles que se desprenden del alimento sólido o líquido Objetivos: extraer analitos de interés lo más concentrados posible elevada recuperación cuantitativa mínimas interferencias Grado en Nutrición Humana y Dietética 8

9 Micro-extracción en fase sólida (SPME) Principios de la Técnica Se basa en la adsorción de los compuestos orgánicos del alimento por una fase sólida inmovilizada sobre una fibra de sílice fundida. Una vez alcanzado el equilibrio, los compuestos adsorbidos se desorben térmicamente en el inyector de un cromatógrafo de gases La matriz puede ser aire, agua, muestras líquidas, etc. Alternativamente, también se puede disolver el extracto en un disolvente orgánico para analizarlo por HPLC. Microextracción en fase sólida (SPME) Principios de la Técnica SPME es una nueva técnica de extracción para compuestos orgánicos, que se basa en la adsorción de los analitos de la matriz (aire, agua, muestras líquidas, etc.) por una fase sólida inmovilizada sobre una fibra de sílice fundida. Si se emplea un recubrimiento polimérico, la cantidad de analito adsorbida por el recubrimiento en equilibrio está relacionada directamente con la concentración en la muestra. Grado en Nutrición Humana y Dietética 9

10 Microextracción en fase sólida (SPME) Esquema del sistema para SPME y detalle de la fibra adsorbente. La fibra es de sílice fundida recubierta de un polímero adsorbente selectivo. Microextracción en fase sólida (SPME) Principio Teórico n = K fh V f V s C o K fh V f +V s n: masa de analito adsorbida por el recubrimiento V f,v s : Volumen de recubrimiento y de muestra K : coeficiente de reparto del analito entre el recubrimiento y la muestra; [K = f ( T, fibra)] C o : concentración inicial del analito en la muestra Grado en Nutrición Humana y Dietética 10

11 Microextracción en fase sólida (SPME) En relación al reparto de los analitos... Principales variables que influyen en el proceso de reparto: constante de distribución temperatura de la muestra y tipo de calentamiento 25 C 130 C 200 C Ventajas y desventajas de la Microextracción en fase sólida Es una técnica rápida y relativamente sencilla Existen diferentes fibras adsorbentes disponibles en el mercado que permiten cierta selectividad Se puede acoplar fácilmente a otras técnicas de separación (GC y HPLC) No requiere ningún disolvente SPME es una técnica económica (reutilizable) Está limitada a muestras líquidas o compuestos volátiles (espacio de cabeza) No permite conservar el extracto para otros análisis Grado en Nutrición Humana y Dietética 11

12 Microextracción en fase sólida (SPME) Aplicaciones: Detección de enranciamiento de aceites por SPME de aldehídos y otros subproductos de la oxidación Análisis de aromas naturales y extraños de alimentos Aromas de vinos, bebidas espirituosas, zumos y otras bebidas Diferenciación de tipos de café, origen, tueste, etc. Compuestos azufrados en cerveza y otras bebidas alcohólicas Caracterización y control de calidad de alimentos de alto valor: jamones, trufas, patés, etc. Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME) Ejemplo de análisis de compuestos volátiles en un zumo de fruta sin usar ningún disolvente tóxico Grado en Nutrición Humana y Dietética 12

13 Diferentes técnicas para problemas distintos Aroma y compuestos volátiles de alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc Espacio de cabeza SPME Componentes naturales o contaminantes de alimentos líquidos: zumos y bebidas, aceites, leche, etc. Muestras sólidas de alimentos: Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos (ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles) Residuos y contaminantes en alimentos Extracción en fase sólida MAE ASE SFE Técnicas de Purga y Trampa y Desorción Térmica Procedimiento arrastre continuo de la muestra por medio de un flujo de gas inerte (He o N2) captura o adsorción de los compuestos volátiles en una trampa adsorbente desorción, mediante calentamiento, de los compuestos retenidos Grado en Nutrición Humana y Dietética 13

14 Técnica de Purga y Trampa Arrastre y captura: Gas inerte: para no alterar componentes de la muestra Temperatura ambiente P&T MS GC Técnica de Purga y Trampa Ventajas y desventajas P&T: Realiza, de forma automática, las etapas de arrastre, captura y desorción Elevada reproducibilidad Evita manipulación de muestra No requiere ningún disolvente Elevada sensibilidad No existen interferencias de compuestos no volátiles de la matriz Optimización de todas las variables en conjunto Grado en Nutrición Humana y Dietética 14

15 Diferentes técnicas para problemas distintos Aroma y compuestos volátiles de alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc Espacio de cabeza SPME Componentes naturales o contaminantes de alimentos líquidos: zumos y bebidas, aceites, leche, etc. Muestras sólidas de alimentos: Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos (ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles) Residuos y contaminantes en alimentos Extracción en fase sólida MAE ASE SFE Esquema Tema 2. AISA Introducción a las técnicas de preparación de muestra Extracción sólido-líquido Extracción líquido-líquido Cromatografía en capa fina y cromatografía en columna Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME, Solid Phase Micro-Extraction) Extracción Asistida por Microondas (MAE, Microwave Assisted Extraction) Extracción Acelerada con Disolventes (ASE, Accelerated Solvent Extraction) Extracción en Fase Sólida (SPE, Solid Phase Extraction) Grado en Nutrición Humana y Dietética 15

16 Diferentes técnicas para problemas distintos Muestras sólidas de alimentos: Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos (ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles) Residuos y contaminantes en alimentos Aroma y compuestos volátiles de alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc MAE ASE SFE Espacio de cabeza SPME Componentes naturales o contaminantes de alimentos líquidos: zumos y bebidas, aceites, leche, etc. Extracción en fase sólida Extracción sólido-líquido: Extracción de alimentos sólidos con disolventes Método tradicional de extracción disolvente orgánico (líquido) caliente, en ebullición, en contacto con muestra de alimento (sólido) Disolvente + extracto (ej. Soxhlet) Temperatura máxima del Disolvente= = Punto de ebullición (60-80ºC) Disolvente Grado en Nutrición Humana y Dietética 16

17 Necesidad de nuevas técnicas de extracción de alimentos sólidos Métodos tradicionales de extracción sólido-líquido : líquido en ebullición en contacto con muestra sólida difusividad del disolvente lenta intercambio de energía poco eficaz procesos estáticos o semi-estáticos Extracción lenta y poco eficaz disolventes convencionales calor como única energía Extracción lenta y poco selectiva Técnicas instrumentales de preparación de muestras de alimentos Pasos previos: Homogeneizar la muestra Reducir su tamaño Evitar cambios en la muestra: Inactivación enzimática Protección de lípidos Inhibición del crecimiento microbiano Cambios físicos, agua, estructura, etc. Congelación, secado, tratamiento térmico, conservantes químicos (o una combinación de varios de ellos) Grado en Nutrición Humana y Dietética 17

18 Extractor Soxhlet Método tradicional, muy aceptado y extendido Lento Esquema Tema 2. La preparación de la muestra Introducción a las técnicas de preparación de muestra Extracción sólido-líquido Extracción líquido-líquido Cromatografía en capa fina y cromatografía en columna Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME, Solid Phase Micro-Extraction) Extracción Asistida por Microondas (MAE, Microwave Assisted Extraction) Extracción Acelerada con Disolventes (ASE, Accelerated Solvent Extraction) Extracción en Fase Sólida (SPE, Solid Phase Extraction) Grado en Nutrición Humana y Dietética 18

19 Técnicas instrumentales de extracción de muestras sólidas de alimentos Principios comunes a las nuevas técnicas de extracción: Extracción asistida por microondas (MAE). Extracción acelerada con disolventes (ASE). Extracción supercrítica analítica (SFE). Se emplean disolventes de alta difusividad elevando la temperatura y controlando la presión Debido a los mayores coeficientes de difusión, las extracciones se aceleran considerablemente Técnicas avanzadas de preparación de muestras de alimentos sólidos Extracciones de sólidos con mayor rapidez y eficacia selectividad Fluidos Supercríticos Energía localizada rendimiento Líquidos a alta Tª Presión elevada SFE MAE ASE Grado en Nutrición Humana y Dietética 19

20 Principios de la Extracción Asistida por Microondas (MAE) Se extrae la muestra aplicando energía de microondas en un disolvente adecuado. Energía de microondas: calienta selectivamente unas especies químicas frente a otras produce extracciones rápidas y con cierta selectividad. El calentamiento producido depende de la naturaleza química de la matriz y del disolvente Cuanto mayor es la constante dieléctrica, mayor es la absorción de energía. Extracción Asistida por Microondas (MAE) Procedimiento habitual Cuando el disolvente absorbe energía microondas: La muestra se coloca en un recipiente cerrado se calienta a temperaturas mayores que su punto de ebullición durante un tiempo muy corto (aumenta la presión) después se enfría y se despresuriza se separa o filtra el extracto Grado en Nutrición Humana y Dietética 20

21 Extracción Asistida por Microondas (MAE) Equipo necesario: Microondas Celdas apropiadas Características de las celdas no absorber microondas, ser inertes, fáciles de abrir y cerrar reutilizables resistentes a altas P y temperaturas Esquema de una celda comercial con control de presión y de temperatura para MAE Extracción Asistida por Microondas (MAE) Principales variables: Relativas a la muestra Disolvente: composición y propiedades constante dieléctrica Potencia de irradiación Caudal de disolvente (en procesos continuos) Tiempo de irradiación y extracción Grado en Nutrición Humana y Dietética 21

22 Extracción Asistida por Microondas (MAE) Ventajas MAE es más rápida (30 seg.-10 min) y emplea menos disolvente (1-15 ml) que la extracción líquida tradicional La energía esta localizada y se aprovecha mejor (menor consumo) El tamaño de muestra puede ser muy variado MAE es una técnica robusta y fácil de usar Se pueden extraer varias muestras a la vez No hace falta deshidratar o procesar la muestra Extracción Asistida por Microondas (MAE) Desventajas MAE depende de la matriz y limita los disolventes que se pueden utilizar MAE plantea problemas de seguridad El extracto queda en contacto con la muestra al acabar la extracción y necesita una posterior filtración o separación MAE es difícil de automatizar o acoplar a técnicas de análisis Degradación de compuestos térmicamente lábiles Poca selectividad en la extracción Grado en Nutrición Humana y Dietética 22

23 Extracción Asistida por Microondas (MAE) Ejemplos de Aplicaciones: Extracción de grasa de carne, huevo y sólidos lácteos Extracción de oleorresina de pimentón Extracción de monoterpenoles de mostos para análisis por GC Esquema de un extractor asistido por microondas Extracción de esencias de vainilla, menta, ginseng, cítricos, etc. Extracción de contaminantes (residuos de pesticidas, PAHs, PCBs, etc.) Ejemplo de Extracción Asistida por Microondas (MAE) Extracción de grasa de carne, huevo y sólidos lácteos Homogeneización de la muestra La muestra se coloca en un recipiente abierto adecuado Se añade el disolvente: éter de petróleo o hexano Se irradia a 300 W durante segundos El extracto se filtra a vacío para separar la muestra del disolvente Se concentra el extracto, evaporando el disolvente en rotavapor Grado en Nutrición Humana y Dietética 23

24 Técnicas avanzadas de preparación de muestras de alimentos sólidos Extracciones de sólidos con mayor rapidez y eficacia selectividad Fluidos Supercríticos Energía localizada rendimiento Líquidos a alta Tª Presión elevada SFE MAE ASE Extracción Acelerada con Disolventes (ASE) Principios de la Técnica nueva técnica de extracción disolventes habituales presiones y temperaturas elevadas extracciones rápidas y efectivas de muestras sólidas Temperaturas: ºC Presiones: atm Disolventes: orgánicos, agua, mezclas, etc. Muestras: sólidas Grado en Nutrición Humana y Dietética 24

25 Extracción Acelerada con Disolventes (ASE) Principios de la Técnica nueva técnica de extracción disolventes habituales presiones y temperaturas elevadas extracciones rápidas y efectivas de muestras sólidas Efectos interesantes que se producen a temperaturas elevadas: mejores solubilidades de los analitos en líquidos aumento de las cinéticas de desorción de los compuestos de la matriz Extracción Acelerada con Disolventes (ASE) Procedimiento La muestra sólida se coloca en un recipiente que se sella Se llena con disolvente y se calienta a temperatura mayor que el punto de ebullición del disolvente, provocando un gran aumento de la presión en la celda. Durante el tiempo de extracción parte del líquido es liberado y recogido en un vial. Al final de la extracción, el extracto se expulsa de la celda con nitrógeno y se transfiere automáticamente a un vial. Grado en Nutrición Humana y Dietética 25

26 Extracción Acelerada con Disolventes (ASE) Principales variables: Relativas a la muestra Disolvente o mezcla de disolventes Tiempo de extracción Temperatura de extracción Número de ciclos Extracción Acelerada con Disolventes (ASE) Válvula de purga Válvula de presión Horno Celda de Extracción Bomba Válvula Estática Disolvente Nitrógeno Salida aire Vial de desecho Vial colector Grado en Nutrición Humana y Dietética 26

27 Extracción Acelerada con Disolventes (ASE) Ejemplos de Aplicaciones: Extracción de grasa de carne, huevo y sólidos lácteos Pesticidas en harinas, piensos, etc. Micotoxinas en cereales y frutos secos Imagen de un extractor con disolventes presurizados (ASE) Extracción de productos naturales Extracción de contaminantes (residuos de pesticidas, dioxinas, PCBs, etc.) Extracción Acelerada con Disolventes (ASE) de alimentos Ventajas ASE TM es más rápida que los procedimientos de extracción líquida tradicionales <15 min frente a 2-24 h ASE emplea menos disolvente <15 ml para 10 g de muestra vs ml ASE es más eficaz independientemente de la matriz ASE es automatizable y puede extraer muestras secuencialmente El desarrollo de métodos es mucho más sencillo Grado en Nutrición Humana y Dietética 27

28 Extracción Acelerada con Disolventes (ASE) de alimentos Desventajas Las extracciones son más completas, pero menos selectivas ASE requiere el empleo de temperaturas más altas que en SFE El equipo tiene un precio elevado Técnicas avanzadas de preparación de muestras de alimentos sólidos Extracciones de sólidos con mayor rapidez y eficacia selectividad Fluidos Supercríticos Energía localizada rendimiento Líquidos a alta Tª Presión elevada SFE MAE ASE Grado en Nutrición Humana y Dietética 28

29 Extracción Analítica con Fluidos Supercríticos (SFE) Principios de la Técnica Se extrae con un fluido a presiones y temperaturas mayores que las de su punto crítico extrae rápida y selectivamente algunos compuestos Variando la presión (la densidad del fluido) se controla la solubilidad de los analitos en dicho fluido. Qué es un Fluido Supercrítico? Diagrama de fases Presión Sólido Líquido Fluido Supercrítico Gas Temperatura Punto Crítico (Para CO 2 es 31.3ºC y 72.9 atm) Grado en Nutrición Humana y Dietética 29

30 Extracción Analítica con Fluidos Supercríticos (SFE) El fluido supercrítico más utilizado es el dióxido de carbono (CO 2 ) Propiedades del dióxido de carbono Moderadas presión (72.9 atm) y temperatura (31.3ºC) críticas Gas a temperatura ambiente, no deja residuos No es tóxico ni inflamable Precio moderado y sin problemas de eliminación Baja polaridad, se pueden añadir modificadores en pequeña proporción para extraer compuestos polares Diferentes técnicas para problemas distintos Componentes naturales o contaminantes de alimentos líquidos: zumos y bebidas, aceites, leche, etc. Aroma y compuestos volátiles de alimentos y bebidas cuyo flavor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc Extracción en fase sólida Espacio de cabeza SPME Muestras sólidas de alimentos: Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos (ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles) Residuos y contaminantes en alimentos MAE ASE SFE Grado en Nutrición Humana y Dietética 30

31 Fundamentos de la Extracción Líquido-Líquido Partición de los componentes de una mezcla entre dos líquidos inmiscibles de diferente densidad Extracción en fase sólida (SPE) Principios de la Técnica SPE es una técnica de extracción que se basa en la retención sobre un adsorbente sólido de los compuestos deseados disueltos en una muestra líquida. La adición de un eluyente permite eliminar los componentes de la matriz que interfieren, para después eluir y concentrar los analitos de interés. La extracción en fase sólida sustituye a la extracción líquido-líquido clásica. Grado en Nutrición Humana y Dietética 31

32 Procedimiento de la Extracción en Fase Sólida (SPE) Muestra Acondicionamiento Adición de muestra Lavado Elución del analito Extracción en Fase Sólida (SPE) Ejemplos de Aplicaciones: Eliminación de pigmentos de vegetales y hortalizas Retención de antocianinas y otras interferencias en análisis de pesticidas en vinos Vitaminas en zumos Residuos de antibióticos en leches Grado en Nutrición Humana y Dietética 32

33 Extracción en Fase Sólida (SPE) Imagen de un colector múltiple para SPE con aspiración a vacío. Permite la extracción simultánea de 20 tubos con muestra. Equipo automático para SPE con microplacas de 96 / 384 Ventajas y desventajas de SPE Es una técnica muy sencilla y rápida Existen numerosos adsorbentes disponibles en el mercado para SPE Se puede acoplar a otras técnicas de separación Emplea poco o ningún disolvente SPE es muy efectiva para extraer compuestos polares o apolares de muestras líquidas Se puede automatizar Está limitada a muestras líquidas Grado en Nutrición Humana y Dietética 33

34 Sumario de propiedades de nuevas técnicas de extracción Eficaces y selectivas Rápidas: tiempos de extracción de 1-30 minutos Posibilidad de automatización Ninguna técnica es ideal para todos los analitos de todas las matrices Las nuevas técnicas son cada vez más comunes y van a continuar su expansión debido a sus numerosas ventajas Bibliografía recomendada Libros sobre Análisis Instrumental incluyendo preparación de muestra: Rubinson K.A., Rubinson J.F. (2001). Análisis Instrumental. Prentice Hall-Pearson. Madrid. Matissek R., Schnepel F.M., Steiner G. (1998). Análisis de los Alimentos. Fundamentos, Métodos, Aplicaciones. Acribia. Zaragoza. Skoog D.A., Holler F.J., Nieman T.A. (2001). Principios de Análisis Instrumental. [Quinta Edición] McGraw-Hill. Madrid. Grado en Nutrición Humana y Dietética 34