DIAGNÓSTICO PRENATAL: DEL MICROSCOPIO A LAS PLATAFORMAS DE ALTO RENDIMIENTO

Transcripción

1 DIAGNÓSTICO PRENATAL: DEL MICROSCOPIO A LAS PLATAFORMAS DE ALTO RENDIMIENTO María Orera U. de Genética HGU Gregorio Marañón CGCGenetics-CircaGen Oviedo

2 cronograma 1966: STEELE: Estudio cromosómico en Líquido amniótico 1972: BROCK: AFP en los defectos de tubo neural 1982: MERKATZ: AFP en alteraciones cromosómicas 2000: QF-PCR /FISH 2003: Técnicas de alto rendimiento (MLPA) 2005: WALD: Screening combinado, detección 95 % 2008: Arrays CGH /Dirigidos

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4 Alteraciones Cromosómicas Grandes Número Cromosomas Translocaciones Inversiones Deleciones e inserciones Estructurales CNV Repeticiones en Tandem Nucleotide Insertions and Deletions (Indels) Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Mutaciones Secuencia Pequeñas

5 ALTERACIONES CROMOSÓMICAS MAS FRECUENTES RECIÉN NACIDOS NO EQUILIBRADAS EQUILIBRADAS TRISOMÍAS % Tr. Recíproca Tr. Robertsoniana Inv.pericéntrica 0.08 Triploidía TRISOMÍAS GONOSOMAS TOTAL XXY XXY X XXX 0.11 Reareglo 0.03 Cr.Extranum 0.04

6 CARIOTIPO CARIOTIPO Gold Standard 46 cromosomas 550 bandas Resolución 10 Mb 100 genes Alteraciones numéricas y estructurales Prevalencia cromosomopatías 0.8%

7 RESULTS Type of Numerical Alteration Total % Num Alt n=733 % Abn Smp n=1.066 % Total Smp n= Trisomy ,5% 36,1% 1,3% Sex chromosome aneuploidies ,4% 12,7% 0,4% Trisomy ,9% 12,3% 0,4% Trisomy ,5% 3,1% 0,1% Triploid 26 3,5% 2,4% 0,1% Markers 21 2,9% 2,0% 0,1% Tetraploid 1 0,1% 0,1% 0,0% Other aneuploidies 1 0,1% 0,1% 0,0% Total ,8% 2,4% Orera, M y cols. Global Congress maternal health 2010

8 RESULTS Type of Structural Alteration Total % Num Alt n=256 % Ab Smp n=1.066 % Total Smp n= Reciprocal balanced translocation 81 31,6% 7,6% 0,3% Inversion 62 24,2% 5,8% 0,2% Robertsonian balanced translocation 40 15,6% 3,8% 0,1% Robertsonian unbalanced translocation 20 7,8% 1,9% 0,1% Deletions 19 7,4% 1,8% 0,1% Other 19 7,4% 1,8% 0,1% Reciprocal unbalanced translocation 15 5,9% 1,4% 0,0% Total ,0% 0,9% Orera, M y cols. Global Congress maternal health 2010

9 RESULTS Type of Mosaic Total % Num Alt % Ab Smp % Total Smp n=77 n=1.066 n= Autosomal mosaic 47 61,0% 4,4% 0,2% Sex chromosome mosaic 30 39,0% 2,8% 0,1% Total 77 7,2% 0,3% Total chromosomal anomalies: 3.6% amniocentesis Orera, M y cols. Global Congress maternal health 2010

10 FISH Marca CE, aprobado FDA Diagnóstico robusto y rápido Detecta mosaicismos de cualquier % Resultados válidos para ILE si hay anomalías ecográficas Sondas de síndromes mas frecuentes Poco automatizable Costoso

11 QF-PCR Rápido y barato Detecta mosaicismos >30% Aprobado para diagnóstico rápido No aprobado para ILE No automatizable

12 BACS on Beads (BoBs) Marca CE BACS inmovilizados en esferas de poliestireno 9 sondas 100 esferas No requiere confirmación con FISH DNA paciente marcado con biotina Amplificación enzimática Estreptavidina ficoeritrina Plataforma Luminex

13 BoBs

14 MLPA Detección de variaciones número de copias de hasta 45 regiones en un ensayo 20 ng ADN Discrimina variaciones de 1 nucleótido Identifica mutaciones puntuales conocidas Reproducible Una estandarización para muchas aplicaciones Económica Requiere poca inversión

15 MLPA PRENATAL Salsas específicas Microdeleciones Subteloméricas Retraso Mental Aneuploidías Aplicable en lisados celulares 3000 células 0.5ml L.A. Resultados 24 horas Frecuencia Combinada Microdelecciones Subteloméricas Aneuploidía 1:250

16 INCONVENIENTES Requiere comparación con control Obligado confirmar por FISH u otro MLPA Sensible a contaminantes No detecta alteraciones equilibradas ni mosaicismos No detecta mutaciones puntuales no conocidas CONTROL

17 ARRAYS

18 ARRAYS ARRAYSARRAYS Secuencias de ADN inmovilizadas en un soporte sólido BACS Oligonucleótidos Arrays CGH Variaciones en Nº de copias 44,105,240 K Arrays dirigidos Genotipado Patologías con heterogeneidad genética Craneosinostosis, Displasias esqueléticas, Metabolopatías A medida Enriquecidos en regiones diana

19 CNV Variaciones de secuencia > 1kb Indels <1Kb Fácilmente detectables por nuevas tecnologías Asociadas a enfermedad Autismo, esquizofrenia, retraso mental Identificación de nuevos síndromes

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22 NEXT GENERATION SEQUENCING Secuenciación completa Detección cambios de secuencia Resolución 1 base No detecta Expansiones Cambios epigenéticos Metilación No distingue Mutación Polimorfismo Variante significado incierto En estudio DP no invasivo

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24 ESTRATEGIAS OPCIONES Estudios dirigidos QF-PCR FISH MLPA Detección mutación específica Arrays genotipado Craneosinostosis Metabolopatías Displasias esqueléticas Utilización Antecedentes Alteraciones en la gestación Resultado cierto y definitivo Existe o no existe trisomía, deleción, mutación Estudios generales Whole genome pb Cariotipo Array CGH Secuenciación completa Utilización Análisis habitual Distinta resolución Resultado incierto Alteraciones no detectadas en cariotipo Interpretación arrays y secuenciación

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26 DP No invasivo Patrón fetal de metilación diferente Identificación en sangre materna mediante RT-PCR Disponible en 2-3 años MLPA Shotgun sequencing

27 COMPARACIÓN Tiempo Coste Detectadas No detectadas Cariotipo 15 días 150 Cromosomopatías Microdeleciones Mutaciones Alt.Metilación BoBs 2 días 250 Cromosomopatías Regiones no incluídas Alt metilación Frecuencia Poblacional 0.8/1000 1/300 MLPA 15 días 300 Cromosomopatías Mutaciones específicas Retraso >50% Regiones no incluídas Alt. Metilación 1/250 Array CGH 15 días 500 Autismo 10% Retraso 7-35% Secuenciación Whole genome Traslocaciones Inversiones Mutaciones >10 /persona > 6 meses $ Mutaciones Alt. Metilación / persona

28 Frecuencia enfermedades genéticas 100 multifactoriales 10 1 monogénicas cromosómicas 0,1

29 PREVALENCIA RETRASO MENTAL Retraso del desarrollo psicomotor (TGD) 1-3% menores de cinco años 20 % causa desconocida 75% causa genética Retraso mental 3% población Causas Prenatal 50% 65% causa genética Perinatal 10% Postnatal 10& Desconocido 30% Autismo Prevalencia 1/90 Causas genéticas 20-30%

30 Diagnóstico Prenatal 30 años después DP Convencional Cariotipo (QF PCR) DP Ampliado PANELES DE SÍNDROMES ASOCIADOS A RETRASO MENTAL BoBs MLPA CGH a medida

31 MANEJO ALTERACIONES ECOGRÁFICAS Marcadores de trisomía QF PCR FISH BoBs Cariotipo Alteración insepecífica Array a medida Hidrops Array Metabolopatías Array Noonan Alteraciones esqueléticas Array Displasias óseas Alteraciones Craneofaciales Array Craneosinostosis Alteraciones cardiacas FISH MLPA Array Metabolopatías

32 ALES Principios éticos del Diagnóstico prenatal Autonomía Justicia Aspectos legales Segundo supuesto de la ley de aborto Sentencias Tribunal Supremo Los médicos tienen la obligación de poner en conocimiento de la gestante toda la información conocida y constatada en orden de determinar las posibilidades efectivas sobre la evolución del embarazo Antonio Seijas, Agosto 2007

33 Autonomía materna Participación en el proceso Información Consentimiento Informado Control de la información Confidencialidad Futuro del feto Capacidad de tomar decisiones Interrupción gestación

34 COSTE / BENEFICIO Macro Coste global por paciente con retraso desarrollo: US$2003* Meso Amortización material inventariable Personal Micro Amniocentesis+Cariotipo+BoBs 500 * CDC 2004

35 Evolución 80 s >35 amniocentesis cariotipo 90 s IR 2º amniocentesis cariotipo FISH/QF PCR 00 s IR1º amniocentesis cariotipo B. corial FISH MLPA 10 s amniocentesis cariotipo B. corial BoB s Arrays 20 s DP no invasivo WGS