Ingeniería Genética II

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1 Ingeniería Genética II

2 Expresión de proteínas recombinantes Vectores de expresión Características adicionales: - Promotor regulable - Terminador de la transcripción - Sitio de reconocimiento por el ribosoma

3 Análisis de la expresión de proteínas recombinantes empleando PAGE IPTG inductor

4 Producción de proteínas recombinantes en bacterias

5 Escalamiento y purificación de la proteína

6 La tecnología de DNA recombinante genera herramientas para estudiar los genes y sus productos Insertar en vector de expresión Deducir secuencia de aminoácidos Transformar E. coli u otro hospedero Preparar péptidos sintéticos Preparar anticuerpos específicos para una proteína Secuencia de aminoácidos Anticuerpo específico Sintetizar sonda específica Escrutinio de una biblioteca de DNA por Southern blot Escrutinio de una biblioteca de expresión por Western blot

7 Western Blot (detección de proteínas específicas empleando anticuerpos)

8 La detección de proteínas sirve para conocer: 1. Niveles de expresión 2. Isoformas 3. Modificaciones postraduccionales 4. Tiempo de vida media y degradación 5. Localización subcelular

9 El uso de anticuerpos permite la localización de proteínas en las estructuras celulares

10 Uso de las técnicas de DNA recombinante en diferentes ámbitos de utilidad al hombre

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13 Aplicaciones las técnicas de DNA recombinante en Biotecnología Vegetal Plantas transgénicas que expresan proteínas que le confieren alguna propiedad agronómica importante: Resistencia a plagas de insectos Resistencia a herbicidas Resistencia a virus Detección de microorganismos patógenos en plantas por métodos moleculares. Virus, bacterias, micoplasmas

14 El mejoramiento tradicional de plantas implica hacer una cruza entre genotipos distintos para incorporar un carácter y luego hacer selección y autocruzas para obtener un homocigoto. Patrón de herencia Mendeliana. Puede llevar varios años hasta obtener el homocigoto con los caracteres deseados.

15 La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento de un gen de cualquier especie e incorporarlo en plantas para que tengan una nueva característica Una limitación importante es la transformación (introducción del DNA) de céluals vegetales. Transformación por bombardeo

16 Transformación de células vegetales T-DNA: plásmido presente en Agrobacterium tumefaciens

17 Agrobacterium tumefasciens produce tumores en las plantas

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19 Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens

20 Transformación por Agrobacterium tumefaciens

21 Proceso de transformacion por Agrobacterium

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23 Transformación por biobalística

24 Aplicación: resistencia a plagas de insectos Gusano barrenador en maíz En las esporas de Bacillus thuringiensis se acumulan proteínas (Cry) con actividad insecticida. Toxinas Bt

25 Mecanismo de acción de las toxinas Bt El insecto ingiere la protoxina al alimentarse del tejido de la planta La protoxina sufre proteólisis en el intestino del insecto y se genera la toxina activa La toxina se une a receptores en las células epiteliales del intestino La toxina se oligomeriza y forma poros en la membrana plasmática de las células epiteliales

26 La toxina Bt es orgánica, por lo tanto es biodegradable Por el uso de cultivos Bt resistentes a insectos: Se reduce el número de aplicaciones de insecticidas. Se incrementa el rendimiento El uso de estos cultivos se ha incrementado mundialmente en los últimos años:

27 Controversias sobre plantas transgénicas. Los vectores para la transformación de plantas tienen marcadores de resistencia a antibióticos como marcadores de selección. La presencia ubicua de estos genes pueden facilitar la transferencia de resistencia a antibióticos a bacterias pátogenas. Generalmente los marcadores de selección son Kan R y Neo R Escape de genes del cultivo transgénico a malezas. Por ej. generación de malezas con capacidades de resistencia a herbicidas.

28 El caso de maíz en México. Riesgos que hay que considerar para diseñar estrategias para evitarlos. México es el centro de origen del maíz. Hay amplia diversidad y especies de maíz silvestre en México. Transferencia de genes a estas especies.

29 Bancos de mutantes en los organismos modelos

30 Clonación en células animales Métodos de transfección Permeabilización química de las membranas Electroporación Liposomas Vectores Vectores derivados de virus animales SV40 Retrovirus Vacuna Vectores mixtos Métodos de selección Detección de actividades enzimáticas Resistencia a inhibidores Resistencia a antibióticos Integración dirigida

31 Transformacion en células eucariontes Biobalística Transformación directa Microinyección Virus

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33 Vectores de expresión para transformar células animales Promotor inducible para animales

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37 Animales transgénicos

38 Mutación en una helicasa causa envejecimiento prematuro

39 Creando ratones Knockout Los ratones knockout permiten estudiar la función de una proteína codificada por un gen

40 La técnica implica la mutación dirigida de un gen específico

41 Medicina genómica/ Terapia génica Introducir células transformadas (con un gen intacto) en el tejido somático para corregir una función defectuosa o en la línea germinal. Inmunodeficiencia combinada sevéra. Defecto en la desaminasa de adenosina. Células madre de la médula ósea se transforman.

42 Problemas potenciales El vector, basado en retrovirus, puede actuar como mutágeno al insertarse en un gen. También, estos vectores basados en retrovirus solamente pueden en células en proliferación, por lo que están limitados a células sanguíneas. Paciente homocigoto para un alelo mutante de LDLR que determina el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR-/LDLR-). Elevado riesgo de ateroesclerosis y enfermedades coronarias. Se extrajo 15% del hígado del paciente. Las células se transformaron con el gen LDLR+ (silvestre). Las células tranformadas se reinyectaron al paciente por la vena porta y se reestableció un número suficiente de células en el hígado en el que se redujeron los niveles de lípidos.

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