1. Motivación. 2. Introducción. Universidad Técnica Federico Santa María Departamento de Informática Campus Santiago

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1 Universidad Técnica Federico Santa María Departamento de Informática Campus Santiago Classification of Normal and Tumor Colon Tissues Using Linear Classifiers and Microarray Data Análisis Inteligente de Datos Taller N o 2 - Vi Motivación Durante los últimos 30 años muchos estudios han relacionado diferentes defectos genéticos con el cáncer, constituyendo cada uno de ellos, una interesante promesa para el entendimiento y la cura de esta enfermedad. El conocimiento actual indica que el cáncer es un proceso de múltiples etapas, cada una de las cuáles se debe generalmente a mutaciones o alteraciones en ciertos genes característicos, cuya acumulación permite que una célula progrese hacia un tumor y luego hacia un cáncer. Por ejemplo, se ha mostrado que las células que carecen de la proteína P 53 no responden bien a radioterapia y que tumores inicialmente benignos pueden evolucionar rápidamente a malignos cuando en sus células se altera la producción de esta proteína. La mejor forma de tratar un cáncer sería entonces determinar cuáles genes modifican sus patrones de actividad o expresión en un tejido enfermo. La tecnología que hace posible el monitoreo de estos patrones de expresión, en miles genes simultáneamente, se denomina microarreglos de ADN. La naturaleza altamente dimensional de los datos obtenidos como consecuencia de esta tecnología, hacen de su análisis una tarea altamente compleja e intensiva computacionalmente, que plantea nuevos e interesantes desafíos a la informática actual. En este taller, trabajaremos con datos correspondientes a los niveles de expresión de 2000 genes de células del colon, sanas y cancerosas, medidos utilizando tecnología de microarreglos. Nuestro trabajo consistirá en construir modelos de clasificación que permitan distinguir células cancerosas de células sanas, en función de sus patrones de expresión. Dada la alta dimensionalidad de las observaciones (2000 características) con respecto al número de muestras (62 pacientes), será necesario que utilicemos técnicas de reducción de dimensionalidad, antes de construir el clasificador. Los modelos de clasificación que consideraremos serán: LDA, QDA y Regresión Logística; mientras que los métodos de extracción de características a analizar serán: PCA (Principal Component Analysis) y PLS (Partial Least Squares). La combinación de estas técnicas ha sido propuesta en un paper relativamente reciente de Nguyen et al. [?] y validada considerando cinco problemas reales correspondientes a cáncer ovárico, linfoma, leucemia, cáncer de colon y cáncer genérico. El trabajo de Alon et al. [?] es otra trabajo donde se analiza el problema que abordamos en este taller. 2. Introducción El colon y el recto forman parte del sistema digestivo. El colon es la primera sección de intestino grueso. En él se siguen absorbiendo nutrientes y agua de los alimentos que han sido ingeridos, como ocurre en el intestino delgado, y sirve de contenedor para el material de desecho. Este material va avanzando hasta el recto, última parte del intestino grueso, hasta que es expulsado al exterior a través del ano. El cáncer colo-rectal consiste en el crecimiento descontrolado de células anormales en esa parte del intestino. Estas células pueden invadir y destruir el tejido que se encuentra a su alrededor. Si penetran en el torrente

2 sanguíneo o linfático, pueden extenderse a cualquier parte del organismo y producir daños en otros órganos. A este proceso de expansión se le denomina metástasis. El cáncer de colon es la tercera causa de muerte por cáncer en Chile, después del cáncer gástrico y hepático. Esta enfermedad, que afecta a hombres y mujeres por igual ha aumentado en un 45 % en los últimos años, por lo que se hace necesario su estudio y caracterización. 3. Expresión Genética El ADN es la base molecular de la herencia. Esta molécula se encuentra funcionalmente dividida en unidades discretas de información denominadas genes, capaces de codificar las síntesis de otras moléculas fundamentales para los procesos celulares denominadas proteínas. Dado que estas proteínas son determinantes en las distintas reacciones que tienen lugar en la célula, todos los procesos celulares dependen en última instancia de la información codificada en el ADN. El color de nuestros ojos, la textura de nuestra piel, y todos nuestros caracteres son consecuencia de la expresión coordinada de cientos de genes codificadores de proteínas. Para recuperar la información codificada en un gen, las células utilizan un proceso denominado expresión genética (gene expression), que de acuerdo al llamado dogma central de la biología molecular. o curre en la siguiente secuencia de eventos 1. El ADN produce una molécula denominada ARN mensajero (Transcripción) 2. El ARN mensajero emigra del núcleo al protoplasma celular 3. El ARN interactúa con los ribosomas y, complementándose con el ARN de transferencia, sintetiza una cadena polipeptídica que, a su vez, forma una proteína. (Traducción) Aunque todas las células del organismo tienen el mismo ADN, es posible observar un comportamiento especializado en diferentes tipos de células. Por ejemplo, las células de la piel difieren significativamente de las células del páncreas o de las neuronas. Esta diferenciación es posible debido a una expresión selectiva

3 de los genes. Es decir, ciertos genes se expresan en mayor o menor cantidad que otros, dependiendo de las proteínas que la célula necesite para su funcionamiento específico. La expresión selectiva de los genes es posible a su vez, gracias a lo que se denomina regulación genética, un conjunto de mecanismos de control que operan a diferentes niveles entre la transcripción y la traducción, utilizando proteínas específicas denominadas factores de regulación. Dado que estas proteínas están codificadas por el mismo genoma, el razonamiento es que los genes interactúan entre ellos (induciéndose o inhibiéndose) para controlar sus niveles de expresión. A esta compleja red de interacciones entre genes, que caracterizan el tipo y momentos de la vida celular, se le denomina red de regulación genética (gene regulation network). La determinación de esta red de interacciones de control es de gran importancia práctica en genómica pues permite comprender y predecir la naturaleza de la actividad celular ante determinadas condiciones de interés, por ejemplo bajo la acción de alguna enfermedad o bajo la administración de algún fármaco. 4. Hibridación de ácidos nucleicos La estructura química de las moléculas de ADN y ARN corresponde a la de ácidos nucleicos, es decir, cadenas de monómeros denominados nucleótidos. Los nucleótidos se encuentran a su vez formados por tres tipos de moléculas diferentes 1. Una base nitrogenada 2. Una pentosa (azúcar) 3. Acido fosfórico de una, dos o tres moléculas En el caso del ADN, la base nitrogenada puede ser Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) ó Timina (T), mientras que la pentosa es del tipo desoxirribosa. En el ARN en cambio, la Timina se reemplaza por Uracilo (U), y la pentosa es del tipo ribosa. La figura (4) muestra a la izquierda la estructura química de un nucleótido. La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cuál se combinan dos cadenas sencillas y complementarias de ácidos nucleicos en una única molécula de doble cadena. Este proceso es posible debido a la atracción química entre las bases nitrogenadas que conforman los nucleótidos. De esta forma, la Adenina es complementaria a la Timina y al Uracilo, y la Citosina es complementaria a la Guanina. Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra rápidamente. Por el contrario, debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos, una simple variación de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión. El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que contiene a la molécula ó por medio de la interacción con enzimas específicas. Producto de la hibridación, el ADN del núcleo se encuentra en forma de dos hebras apareadas, que son complementarias, como muestra la figura (4)a la derecha. Esto le confiere estabilidad química y por otro lado lo obliga a existir en forma de una doble hélice tridimensional que se forma producto de las polaridades invertidas de cada hebra.

4 5. Transcripción ADN-ARN La transcripción del ADN es el primer proceso de la expresión genética. Durante la transcripción genética, las secuencias de ADN, presentes en el núcleo de la célula, son copiadas a ARN mediante una enzima llamada ARN-polimerasa. El tipo de ARN producido se llama ARN mensajero pues su misión es llevar la información codificada en el ADN hacia los ribosomas, donde se sintetizan las proteínas. La transcripción se inicia con la unión de la ARN-polimerasa a una región específica del ADN denominada promotor. La ARN polimerasa se mueve luego a lo largo de la cadena molde del ADN agregando nucleótidos, para formar ARN, de acuerdo a la secuencia dada por ésta. Si encuentra una Citosina, copia Guanina. Si encuentra Guanina copia Citosina. Si encuentra Adenina copia Uracilo, y si encuentra Timina copia Adenina. Notemos que la cadena que en realidad se copia no es la cadena molde sino la complementaria a la molde. Además, la polimerasa nunca copia Timina, si no que la reemplaza por el Uracilo que también es complementario a la Adenina. La fugura 5 esquematiza este proceso.

5 La transcripción termina cuando la polimerasa se encuentra con segmentos específicos del ADN que codifican el término de la copia. Notemos que mientras la polimerasa trabaja, la hebra de ARN que se esta generando es complementaria a la hebra molde de ADN y por lo tanto forman un complejo estable ADN-ARN. Cuando los segmentos de término son transcritos, la hebra de ARN toma una estructura que desestabiliza el complejo ADN-ARN y termina separando las hebras. Una vez ocurrido esto, el ARN mensajero emigra del núcleo celular. 6. Traducción ARN-Aminoácidos El ARN mensajero maduro contiene la información para que los aminoácidos que constituyen una proteína vayan añadiendo según la secuencia correcta. Para ello, cada triplete de nucleótidos consecutivos (codón) especifica un aminoácido de acuerdo a lo que se denomina el código genético. Dado que el m-rna contiene 4 bases, el número de combinaciones posibles de grupos de 3 es de 64, número más que suficiente para codificar los 20 aminoácidos que componen todas las proteínas. El proceso de traducción toma lugar en un organelo celular conocido como ribosoma. Allí se lleva a cabo un proceso por el cual una molécula denomina ARN de transferencia, transporta los aminoácidos codificados por el ARN mensajero a una zona específica del ribosoma. En este lugar, ciertas enzimas específicas, desestabilizan

6 el ARN de transferencia y facilitan la unión del aminoácido liberado con los aminoácidos ya decodificados. El término de este proceso da como producto una cadena de aminoácidos que se tranformará luego en una proteína. 7. Medición de la Expresión Genética: Microarreglos de ADN Los microarreglos de ADN (DNA microarray) son arreglos bidimensionales microscópicos, donde se ubican secuencias de los nucleótidos característicos del ADN, inmovilizadas sobre substratos sólidos como vidrio, plástico o chips de silicio. Cada ubicación de este arreglo se denomina spot. Actualmente existen dos tecnologías principales: los denominados microarreglos de ADN complementario ó cdna (cdna microarrays), también llamados microarreglos de doble canal, y los microarreglos de oligonucleótidos (oligonucleotide microarrays), también llamados microarreglos de canal simple ó Affymetrix microarrays por la empresa que tiene patentada la tecnología. La función de un microarreglo de ADN es medir los niveles de expresión de múltiples genes en una célula, mediante la cuantificación de los productos intermedios derivados de la actividad de dichos genes, específicamente el ARN mensajero (mrna) observado en el citoplasma celular. Como hemos dicho, dada la naturaleza complementaria de los nucleótidos que forman el ADN y el ARN, cada secuencia de nucleótidos tiene una secuencia complementaria con la que existe una afinidad electroquímica que induce la union de las hebras, proceso que se denomina hibridación. Esta es la clave de ambas tecnologías de microarreglos. Cada spot de un microarreglo de dos canales representa un gen, en el que se depositan hebras amplificadas de ADN, con la secuencia característica del gen. Esta tecnología se utiliza preferentemente para medir patrones de expresiones comparativos. Se toman muestras correspondientes a los dos tipos de células que nos interesa analizar (una puede ser de control) y se extrae de ellas el ARN mensajero presente en el citoplasma. El ARN de cada muestra se somete a una reacción de transcripción inversa que da lugar a una hebra de ADN complementario a la secuencia de ADN característica del gen responsable de la hebra de ARN original. De esta forma, si el gen representado por un determinado spot está altamente expresado, al pasar por el microarreglo, muchas hebras de ADN complementario hibridizarán con el spot. Para diferenciar a los dos tipos de células, durante la reacción de transcripción inversa, las hebras de ADN complementario resultantes se tinturan con distintos colores. La figura (7) esquematiza este proceso. En el caso de un microarreglo de canal simple, en cambio, cada spot corresponde a un fragmento característico de la secuencia de ADN característica de un gen que ha sido sintetizada directamente en la placa. Cada gen es representado con 20 a 80 pares de estas secuencias características. Cada par esta formado por la secuencia características propiamente tal y además una modificación de la secuencia que permite detectar hibridaciones artificiales. Esta tecnología es muchísimo más precisa que los microarreglos de dos canales y permite medir con alta precisión los niveles de expresión absolutos de un conjunto de genes, no relativos a una muestra de referencia. 8. Actividades Para este taller ustedes recibirán datos correspondientes a los niveles de expresión de 2000 genes de células humanas correspondientes al colon. Estos niveles de expresión fueron registrados sobre un total de 62 muestras utilizando microarreglos de canal simple. De estas muestras, 22 corresponden a pacientes con cáncer y 40 a pacientes sin cáncer. El objetivo es construir un clasificador que permita distinguir entre ambos tipos de células.

7 1. Analizar el desempeño de un algoritmo basado en PCA y QDA que permita clasificar los datos correspondientes a este problema, considerando diferente número K de direcciones principales. Defina un criterio para seleccionar K. 2. Analizar el desempeño de un algoritmo basado en PLS y QDA que permita clasificar los datos correspondientes a este problema, considerando diferente número M de direcciones características determinadas con el algoritmo PLS. Defina un criterio para seleccionar M. 3. Analizar el desempeño de un algoritmo basado en PCA y Regresión Logística que permita clasificar los datos correspondientes a este problema, considerando diferente número K de direcciones principales. Defina un criterio para seleccionar K. 4. Analizar el desempeño de un algoritmo basado en PLS y Regresión Logística que permita clasificar los datos correspondientes a este problema, considerando diferente número M de direcciones características determinadas con el algoritmo PLS. Defina un criterio para seleccionar M. 5. Comparar los resultados obtenidos con diferentes algoritmos, estableciendo una medida de comparación. 6. Comparar sus resultados con los resultados obtenidos por Nguyen et al. en [?]. Observaciones (a) El taller puede ser resuelto en equipos de 2 personas. (b) Se debe presentar un informe una semana después de revisado en taller. RÑ/LA TEX

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