Una Alternativa Biotecnológica para la Industria del Tequila Cultivo de Callos de Agave tequilana Weber Var. Azul

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1 Una Alternativa Biotecnológica para la Industria del Tequila Cultivo de Callos de Agave tequilana Weber Var. Azul Raúl Erick Juárez Hernández 1, Karla Karina Valenzuela Sánchez 2, Sosa Morales María Elena 1 * y Octavio Paredes López 2 1 Departamento de Ingeniería Química y Alimentos, Universidad de las Américas, Puebla. Ex-Hda. Sta. Catarina Mártir, Cholula, Pue Tel. (222) Fax (222) mariae.sosa@udlap.mx. 2 Laboratorio de Biotecnología de Alimentos, Departamento de Biotecnología y Bioquímica, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN), Unidad Irapuato. Apdo. Postal 629, Irapuato, Gto. Resumen Se evaluaron 12 tratamientos para establecer un sistema de cultivo de callos organogénicos de Agave tequilana Weber var. Azul, empleando diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento; 2 auxinas: Ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) y ácido naftalenacético (NAA), además de una citocinina: 6-Bencilaminopurina (BAP). Los tratamientos se dividieron en dos grupos, uno para cada auxina y dentro de cada grupo se emplearon tres concentraciones diferentes de ésta sin adición de BAP: 0.125, 0.25 y 0.5 mg/l para 2,4-D y 0.25, 0.5 y 1.0 mg/l para NAA; así como sus correspondientes tratamientos complementarios en los cuales se incluyó la citocinina a una concentración constante (5 mg/l). La mejor respuesta fue obtenida con aquellos que incluían citocinina, siendo el sistema DB1 el que mayor crecimiento y capacidad de regeneración mostró. Los tratamientos que sólo emplearon 2,4-D sin citocinina tuvieron limitadas características en los explantes y baja capacidadde brotación. Los tratamientos que emplearon NAA como auxina presentaron características aceptables, además de una capacidad de regeneración superior a los sistemas con 2, 4-D, lo cual permite considerarlos como una alternativa viable en el desarrollo de un sistema de regeneración de A. tequilana. Introducción El tequila ha sido desde hace mucho tiempo parte de la cultura mexicana; la importancia que ha adquirido recientemente está enfocada principalmente a la economía del país y a su reconocimiento internacional; sin embargo, su industria no se encuentra exenta de situaciones que la afectan; como tiempos de cosecha muy largos, baja variabilidad de su materia prima, el Agave tequilana Weber var. Azul, lo cual incrementa la susceptibilidad a daños por enfermedades o plagas. Una de las alternativas para disminuir los problemas relacionados con los cultivos ha sido la modificación genética, la cual permite generar especimenes que posean mejores 114

2 cualidades nutrimentales, mayor resistencia a factores ambientales, enfermedades y/o plagas, o bien, que presenten características agronómicas deseables (Pérez, 1998). La ingeniería genética y la biotecnología proporcionan herramientas versátiles que podrían ayudar a disminuir algunos de estos factores que afectan al agave tequilero. La evidencia de la necesidad de nuevas opciones se refleja en algunas iniciativas, como la del consejo Regulador del Tequila, en la que se reúnen esfuerzos de diversas instituciones de educación superior e investigación para proponer soluciones a la problemática del agave tequilero en la zona de denominación de origen (Garrido y Rodríguez, 2004). El CINVESTAV-IPN Unidad Irapuato, está desarrollando un proceso de regeneración y transformación de agave tequilero; dentro de este proyecto existe la necesidad de establecer un sistema que permita el mantenimiento del estado de callo de esta planta como parte de un sistema de regeneración para su uso en transformación genética. Por lo que el objetivo del presente trabajo fue probar dos reguladores de crecimiento que mantengan el estado de callo de Agave tequilana Weber var. Azul para su posterior empleo en ensayos de ingeniería genética. Materiales y Métodos Se utilizaron plantas de invernadero de Agave tequilana Weber var. Azul de un año de edad, donadas por el Instituto de Ciencias Agrícolas (ICA) de la Universidad de Guanajuato. Se emplearon tres reguladores de crecimiento; dos auxinas: Ácido 2,4- diclorofenoxiacético, 2,4-D (C 8 H 6 Cl 2 O 3 ), de Sigma y ácido 1-naftalenacético, NAA (C 12 H 10 O 2 ) de J. T. Baker Chemical así como una citocinina: 6-bencilaminopurina, BAP (C 12 H 11 N 5 ) de Sigma (Figura 1). 115

3 a) b) c) Figura 1. Reguladores de crecimiento: a) 2,4-D, b) NAA y c) BAP. Se cortaron los agaves eliminando las hojas y raíces hasta dejar únicamente una porción que correspondía al cuerpo o piña, posteriormente se realizó un lavado y se colocaron en solución detergente-agua por 24 horas, realizando el cambio de ésta cada 4 horas. Las piñas se redujeron de tamaño (a partir de esta etapa el resto del de los pasos se efectuaron en campana de flujo laminar y bajo condiciones estériles) mediante cortes a las piñas hasta la obtención de segmentos cilíndricos: 1.5 a 2 cm de diámetro aproximadamente. Los tejidos fueron mantenidos en cámaras de incubación a 25±1º C siguiendo un ciclo que consistió en 16 horas de fotoperiodo y 8 de oscuridad diariamente. Una vez que se hubo establecido la estructura callosa (que tardó de 2 a 3 semanas en formarse), ésta fue segmentada para obtener explantes de 0.5 cm 2 los cuales se transfirieron a los tratamientos con diferentes reguladores de crecimiento. Los explantes fueron observados semanalmente registrando características como presencia de oxidación, existencia de brotes y/o estructura celular desorganizada (friabilidad); su crecimiento fue determinado mediante medición y la determinación de un área superficial aproximada de acuerdo a la forma geométrica correspondiente. Los tratamientos empleados para observar el efecto de auxinas (sola) fueron complementados con una citocinina, BAP, que se manejó a una concentración final en el medio de 5 mg/l y que fue resultado de ensayos previos para lograr el mantenimiento del estado de callo en Agave tequilana; se generaron los 6 medios correspondientes, tres para la combinación 2,4-D y BAP (DB), así como sus análogos para NAA y BAP (NB), (Tabla 1). 116

4 Tabla 1. Especificación de los 12 tratamientos evaluados en el mantenimiento de callos organogénicos de A. tequilana. Auxina Concentración (mg/l) Citocinina (BAP) Tratamiento 2,4-D D1 2,4-D D2 2,4-D D3 2,4-D mg/l DB1 2,4-D mg/l DB2 2,4-D mg/l DB3 NAA N1 NAA N2 NAA N3 NAA mg/l NB1 NAA mg/l NB2 NAA mg/l NB3 Capacidad de brotación. Después de ser mantenidos en los diversos tratamientos por un lapso de 6 semanas, los callos fueron transferidos a medio MS1 modificado para verificar su capacidad de brotación; cuando éstos se empezaron a formar, se transfirieron a medio MSR1 para inducir la formación de raíces (propagación in vitro); mientras que los callos se siguieron manteniendo en un medio MSC. En esta etapa se analizaron semanalmente la cantidad de brotes producidos, la presencia de vitrificación en los mismos, así como la posible oxidación del callo. Durante los experimentos de brotación y mantenimiento de callo, los tejidos fueron manejados en frascos de vidrio y conservados en una cámara de cultivo a una temperatura de 25±1ºC con un fotoperiodo de 16 horas y oscuro de 8 horas. Resultados y Discusión Los resultados obtenidos muestran que para el caso de los tratamientos con 2,4-D la mejor respuesta fue obtenida con aquellos que incluían citocinina, siendo el sistema DB1 el que mayor crecimiento y capacidad de regeneración mostró. Los tratamientos que sólo emplearon 2,4-D sin citocinina tuvieron limitadas características en los explantes además de muy baja capacidad para la producción de brotes. Los tratamientos que emplearon NAA 117

5 como auxina presentaron características aceptables: bajos niveles de oxidación, alta friabilidad y crecimiento además de una capacidad de regeneración superior a los sistemas con 2, 4-D, lo cual permite considerarlos como una alternativa viable en el desarrollo de un sistema de regeneración de A. tequilana; el mejor sistema de éstos fue el N3; los tratamientos complementarios (NB), a diferencia de los DB, no generaron mejores resultados en ninguno de los parámetros evaluados. Nikam y col. (2003) reportaron que NAA en mg/l combinado con KN 1-2 mg/l, inducían la embriogénesis somática en A. sisalana pero que concentraciones más elevadas de la auxina (3 mg/l) y de la citocinina, KN o BAP, (3 mg/l) no lo hacían. También se ha empleado en otros estudios de manera combinada con auxinas y citocininas para inducir embriogénesi;, sin embargo, de acuerdo a lo reportado por Nava (1988), a niveles menores a 1 mg/l no se observó este fenómeno en A. tequilana. La diferencia que se observó entre las dos auxinas empleadas: 2,4-D y NAA es que la segunda tiene un efecto más potente; lo que se muestra claramente al inducir una mayor friabilidad en los explantes, tal y como Nava lo había observado, sin embargo la mayor parte de los trabajos reportan el empleo del 2,4-D y en menor proporción del NAA. En cuanto a la brotación, se observó el efecto del NAA sobre el estado de callo de los explantes de A. tequilana, y se puede concluir que proporcionaba mejores resultados que el 2,4-D cuando se manejaba de forma aislada (sin presencia de citocinina), sin embargo la baja incidencia de brotes en este estado hacía pensar que su capacidad de regeneración sería menor que la correspondiente a los tratamientos con la otra auxina; esto resultó incorrecto puesto que al analizar el tratamiento N1, se obtuvo mayor potencial de regenerabilidad. El tratamiento N2 generó explantes con mejores características que los del N1: más grandes, más friables y con menor cantidad de brotes en el estado de callo; cuando éstos se sometieron al medio de regeneración se obtuvo un resultado muy por encima de cualquiera de los proporcionados por los tratamientos con 2,4-D. Estos resultados fueron muy favorables e indican que el NAA posee un gran potencial tanto para mantener el estado de las células callosas, aumentar su friabilidad pero sobre todo para regenerar una planta del agave tequilero lo cual es uno de los objetivos más importantes del presente trabajo. 118

6 Agradecimeintos Los autores agradecen al Consejo de Ciencia y Tecnología de Guanajuato CONCyTEG por apoyar económicamente al desarrollo de este trabajo mediante el proyecto: Regeneración y transformación de agave tequilero (Agave tequilana). Bibliografía Garrido, L., y Rodríguez, B., Avances de la Investigación en el Agave Tequilero. Consejo Regulador del Tequila A. C. México. Nava, A Agave tequilana WEBER AZUL in vitro: UN MODELO PARA ESTUDIOS EN MORFOGENESIS (sic). Tesis de Maestría. Colegio de Postgraduados. Nikam, T Somatic embryogenesis in sisal (Agave sisalana Perr. ex. Engelm). Plant and Cell Reports 22: Pérez, J Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología: Introducción a la Mejora de Plantas. Instituto de Biotecnología de las Plantas. Cuba. 119