1. Título. Cuantificacion de ADN por espectrofluorometría mediante el uso de Quant- it PicoGreen dsaadnssay Kit (Invitrogen ).

Transcripción

1 1. Título. Cuantificacion de ADN por espectrofluorometría mediante el uso de QuantiT PicoGreen dsaadnssay Kit (Invitrogen ). 2. Finalidad. El presente documento describe el Procedimiento Normalizado de Trabajo (PNT) para la cuantificación de librerías o de ADN genómico mediante el uso de espectrofluorometría utilizando el equipamiento GLOMAX Multi+ DetectionSystem (Promega) y los reactivos necesarios para ello, presentes en el kit QuantiT PicoGreen dsaadnssay Kit (Invitrogen ). 3. Contenido. 1. Título. 2. Finalidad. 3. Contenido 4. Definiciones. 5. Resumen. 6. Ámbito de aplicación y sustancias analizables. 7. Material e instrumental 8. Reactivos 9. Seguridad. 10. Condiciones preanalíticas de las muestras. 11. Preparación de las muestras: Protocolo 12. Condiciones instrumentales. 13. Resultados Expresión de resultados y cálculos Parámetros de control de calidad Evaluación de resultados. 14. Archivo. 4. Definiciones. No procede 5. Resumen. Este procedimiento permite la cuantificación de la cantidad total de ADN presente en una muestra, tanto si se trata de productos de PCR amplificados para la creación de librerías, como para la cuantificación de ADNs genómicos. El proceso implica la creación de una recta patrón a partir de diluciones seriadas de ADN de concentración inicial conocida y la interpolación en esta recta de los valores obtenidos para las muestras a cuantificar.

2 6. Ámbito de aplicación y sustancias analizables. El procedimiento se aplica a muestras de ADN genómico humano, originario de muestras humanas de sangre periférica, saliva, o inclusiones en parafina de tejido tumoral, así como para productos de amplificación de reacción en cadena de polimerasa (PCR) cuando el protocolo se integra dentro del protocolo general de creación de librerías de ADN por PCR. 7. Material e instrumental Guantes de nitrilo Pipeta de volumen variable de 0,5 a 10 µl. Pipeta de volumen variable de 10 a 100 µl. Pipeta de volumen variable de 100 µl a 1 ml. Pipeta multicanal de volumen variable de 0,5 a 10 µl Pipeta multicanal de volumen variable de 10 a 100 µl Pipeta multicanal de volumen variable de 50a 1000 µl Puntas con filtro para pipetas de volúmenes variables de 0,5 µl a 10 µl Puntas con filtro para pipetas de volúmenes variables de 10 µl a 100 µl. Puntas con filtro para pipetas de volúmenes variables de 50 µl a 1 ml Tubos de plástico de 1,5ml. Placas para cuantificación por fluorimetría: Plate black 96 well, flat bottom, medium binding (Greiner bioone). Espectrofluorímetro GLOMAX Multi+ DetectionSystem (Promega) Centrífuga de placas. Vortex Campana de flujo laminar 8. Reactivos. QuantiT PicoGreen dsaadnssay Kit (Invitrogen ): Compuesto por dos reactivos a usar, DNA standar de concentración conocida y el propio reactivo fluorescente (picogreen). Tampon TE 1X Agua para biología molecular (libre de DNA, DNsas y RNasas) 9. Seguridad. Se recomienda el empleo de guantes desechables durante todo el proceso, y tomar todas las precauciones necesarias para la manipulación de muestras biológicas con riesgo de contagio.

3 10. Condiciones preanalíticas de muestras y reactivos. Las muestras a analizar y todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente para realizar la determinación. 11. Preparación de las muestras: PROTOCOLO 1. Preparar la recta patrón con el DNA estándar del kit de PicoGreen. 2. Marca 11 eppendorfs del 1 al 11 y añade las siguientes cantidades de TE 1X (campana): a. Tubo 1: 594 µl b. Tubos 211: 300 µl 3. Transfiere 6 µl del DNA estándar al tubo 1 y vortexea durante 10 seg.(campana) 4. Transfiere 300 µl del tubo 1 al tubo 2 y vortexea durante 10 seg y continua la serie de diluciones. El tubo 8 (ó 11) es el control negativo, no hay que pasarle nada desde el tubo 7 (ó 10). (campana): 5. Transfiere 100 µl de cada tubo a la placa de cuantificación. (campana) 6. Transfiere 99µl de TE 1X a cada pocillo de la placa en tantas posiciones como muestras tengas.(campana) 7. Transfiere 1 µl de cada muestra. Si has hecho la purificación por Pippin tienes que cargar tanto la muestra original como la purificada por Pippin. 8. Mezcla con la pipeta. 9. Añade 100 µl de una dilución 1:200 del reactivo PicoGreen a cada pocillo Lectura de Picogreen. Preparar el Excel con los tamaños de los fragmentos para medir concentraciones. 10. Comprueba las concentraciones en la plantilla correspondiente. 11. Diluye las muestras con los volúmenes indicados en la plantilla para alcanzar la concentración y mezcla las muestras para formar el pool en caso de diagnóstico, en caso de investigación se cuantifica el pool antes del pippin y después del pippin. También se hará un Qiaxcel de los dos pools para verificar que se han eliminado los dímeros. Las diluciones del punto 12 y 13 se preparan cuando ya estemos preparando la empcr. 12. Diluye el pool de muestras de hasta (2 µl del pool en 198 µl de TE 1X). 13. Diluye el pool de muestras de hasta (4 µl del pool en 16 µl de TE 1X). Doc. De picogreen

4 Selecciónà Datos. Texto en columnas Delimitado por comas y tab Reemplazar. por, 12. Condiciones instrumentales Procedimiento de manejo del florimetro GLOMAX Multi+ DetectionSystem (Promega) Encender el instrumento. Verificar su operatividad. Una vez ha arrancado, en la pantalla táctil, seleccionar el tipo de protocolo: Select protocol: Fluorescence protocol Optical kit: BLUE (490/510570). Presionar OK. Presionar sobre el icono de la placa. Seleccionar los pocillos ocupados en la lectura. Presionar OK. Presionar DOOR. Se abrirá la puerta del instrumento. Colocar la placa de lectura en la disposición correcta (indicada en el soporte) Volver a presionar DOOR para cerrar la puerta. Presionar start. Una vez terminada la lectura, guardar los datos en el pendrive. Analizar los resultados (creación de la recta patrón e interpolación de las medidas tomadas para las muestras) en una hoja Excel en cualquier ordenador. 13. Resultados. No está contemplada la comunicación definitiva de resultados en este protocolo. La observación correcta de lo obtenido permitirá continuar con el proceso siguiente. Si las cantidades de ADN medidas lo permiten, se puede continuar con el paso subsiguiente dentro del protocolo en el que esté integrada la medición descrita en este PNT Parámetros de control de calidad interno. El control de calidad en el análisis de cada muestra se realiza mediante los criterios descritos habituales: Observación de resultado positivo en los controles positivos, y observación de resultado no positivo en los controles negativos si procede. En este caso se verifica en cada medición que los reactivos cumplen con los requisitos necesarios al verificar la calidad de la curva de regresión obtenida a partir de los productos surtidos por el kit.

5 13.2. Evaluación de resultados. 1. Comprobar que los parámetros de control de calidad interno se cumplen. Si no se cumplen, se comunicará a la persona responsable del ensayo. 2. La evaluación de resultados se registrará convenientemente. 3. Los resultados de evaluación serán comunicados a la persona responsable. 4. La documentación analítica será archivada según se describe en el apartado 14 de este PNT. 14. Archivo. 1. Toda la documentación analítica se introducirá en una carpeta identificada con el código o el nombre del procedimiento, las muestras contenidas y fecha. Los archivos electrónicos serán guardados en copias de seguridad.