Pruebas complementarias en el diagnóstico de las leucemias mieloides agudas. Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018

Transcripción

1 Pruebas complementarias en el diagnóstico de las leucemias mieloides agudas

2 : Hospitales Universitarios : Hospitales de medicina especializada: Amphia Hospital, Breda Holanda

3 Laboratorio de análisis clinico Hemocitometría Citología de médula ósea Citometría de flujo

4 El diagnóstico de LAM Morfología/histologia Citogenética Citometría de flujo Análisis Molecular

5 La citología de la médula ósea

6 Esquema de la hematopoyesis

7 Lugares con hematopoyesis en el esqueleto

8 Aspiración de médula ósea

9 Aspiración de médula ósea 1 ml -3 ml en una jeringa Hacer extensiones directamente Preservar la muestra en EDTA hacer extensiones en una hora Coagulación rápida leucemia aguda promielocítica? Dry tap mielofibrosis?

10 Preparar los frotis de la médula ósea

11 Plankje met preparaten Tición May Grünwald Giemsa Tinción de Perl s

12 El estroma Hematopoyesis Grasa

13 Valor normal del medulograma (%)* Eritroblastos Mieloblastos 1-5 Promielocitos 0-3 Mielocitos 3-12 Metamielocitos 4-6 Granulocitos neutrófilos bandas Granulocitos neutrófilos Granulocitos eosinófilos 0-4 Granulocitos basófilos 0-1 Monocitos 0-3 Linfocitos 6-20 Células plasmáticas 0-2 Predominio mieloide sobre eritroide (M/E) 3-7 * B Bain et al. Bone marrow pathology (4th edition). Wiley Blackwell

14 Directrices para el recuento celular - sangre periférica : 200 células - médula ósea: 500 células, usando al menos 2 frotis - estimar la cantidad de megacariocitos en 5 campos a 10x10 - evaluar la displasia en la médula ósea: células de la granulopoyesis (neutrófilos, eos, basos) células de la eritropoyesis - 30 megacariocitos - síndrome mielodisplásico: > 10 % displasia WHO 2008/2016

15 Esquema de la hematopoiesis celula madre mieloblasto eritroblasto linfocito monocito neutrófilo eosinófilo basófilo

16 Efecto de LAM al hematopoiesis celula madre mieloblasto X eritroblasto linfocito monocito neutrófilo eosinófilo basófilo

17 Efecto de LAM al hematopoiesis mieloblasto

18 médula ósea normal médula ósea con LAM

19 Tratamiento de LAM con citostáticos

20 Leucemia refractaria (día 17 después tratamiento) o c i n í l C io r o t a r o b a L l a n o i c a N o s e r g n o C tratamiento eficiente leucemia refractaria

21 La histología de la medula ósea

22 Las herramientas..

23 Una biopsia de médula ósea.

24 Una selección de las varias tinciónes histoquimicas y inmunoquimicas para la médula ósea.

25 Médula ósea normal Médula ósea de LAM

26 Inmunofenotipo con citometría de flujo

27 Esquema de las células hematopoyéticas con expresión de moleculas extracelular e intracelular específicas para las diferentes etapas de maduración. Marcador especifíco Marcador de maduración Marcador inmaduro Marcador pan leucocitario

28 Detección inmunofenotípica de moleculas extracelular y intracelular especificas para las diferentes etapas de maduración. Anticuerpo fluorescente contra el marcador de maduración Anticuerpo fluorescente contra el marcador inmaduro Marcador especifíco Marcador de maduración Marcador inmaduro Marcador pan leucocitario

29 Espresión de los varios antígenos de membrana y los antígenos intracelulares durante las etapas de la maduración mieloida progenitor mieloido HLA-DR CD34 CD117 (CD13) (CD33) (CD7) (TdT) MPO progenitor mielomonocitoido HLA-DR CD34 CD117 CD13 CD33 CD65) (CD11c) (CD15) megakarioblasto inmaduro HLA-DR CD34 CD33 (CD36) (CD41/CD61) (CD42) MPO monoblasto HLA-DR CD13 CD33 CD65 CD11c CD14 CD36 MPO MPO MPO MPO mieloblasto (HLA-DR) CD13 CD33 CD65 CD15 proeritroblasto CD36 H antigeno (GpA) megakarioblasto CD36 CD41/CD61 CD42 (CD9) promielocito CD13 CD33 CD65 (CD15) eritroblasto CD36 H antigeno GpA promonocito HLA-DR CD13 CD33 CD65 CD11c CD14 CD36 mielocito megakariocito CD36 CD41/CD61 CD42 CD9 CD13 CD33 CD65 CD15 CD66b MPO monocito HLA-DR CD13 CD33 CD65 CD11c CD14 CD36 MPO granulocito CD13 CD65 CD15 CD66b CD16 eritrocitos H antigeno GpA trombocitos CD36 CD41/CD61 CD42 CD9 CyCD68 macrófago HLA-DR (CD13) (CD33) CD11c (CD14) (CD36) (CD1) CD68 RFD9

30 El sistema de citometría de flujo

31 Scatergrama de dispersión lateral con CD45: el mapa general de la médula ósea Dispersión lateral (SSC) Médula ósea normal Intensidad del marcador CD45 mielopoyesis monocitos lugar de los mieloblastos linfocitos CD45: antígeno universal para células hematológicas

32 Aplicaciones de la citometría de flujo El diagnóstico de LAM Enfermedad mínima residual (EMR) Cuantificación de células madre (CD34+) Pronóstico

33 La citogenética

34 El cariotipo humano

35 Esquema de lesiones cromosómicas más frecuentes. Deleción Duplicación Inversión Inserción Translocación

36 Cariotipo clásico con translocación entre las cromosomas 8 y 21. (t 8:21)

37 Hibridación in situ fluorescente (FISH) de translocación entre cromosoma 8 y 21 ( t8:21) cromosoma 8 intacto cromosoma 21 intacto cromosomas 8 y 21 con intercambio de partes

38 Supervivencia de LAM con una alteración cromosómica que muestra el valor de la citogenética para el pronóstico Probabilidad de sobrevivencia Años NEJM 2016; 374:

39 Analisis molecular

40 Secuenciación masiva de nueva generación (NGS)

41 Las mutaciones más comunes en LAM Función del geno: Blood 2016;12:

42 El efecto del tipo de mutación a la superviviencia en LAM años Blood 2016;12: Sobreviviencia sin recaída

43 NGS y citometría de flujo (MFC) son complementarios en la detección de enfermedad mínima residual (EMR) Porcentage de recaída Meses NEJM 2018, M Jongen

44 Significado del análisis molecular para el tratamiento Ayuda en la clasificación de LAM Mejora el valor del pronóstico de LAM Detección de EMR con alta sensibilidad Predicción de LAM algunos años antes del diagnóstico Desarollo de medicamentos nuevos que se basen en las lesiones moleculares de LAM

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46 El efecto del tratamiento con un inductor de diferenciación en LAM : mieloblasto : promielocito : neutrófilo

47 Tratamiento de LAM con inhibidor de IDH induce maduración de los blastos leucémicos. diagnóstico día 17 de terapia día 24 de terapia

48 El futuro del diagnóstico de LAM (1) La citología y la histología mantendrán su importancia para el diagnóstico inicial. La morfología de los blastos leucémicos no importa mucho para la terapia. (excepto: LAP) La clasificación de LAM se basará especialmente en la citogenética, el análisis molecular y posiblemente terapias anteriores del paciente. La combinación de citometria de flujo y NGS permite la detección de EMR con alta sensibilidad.

49 El futuro del diagnóstico de LAM (2) El análisis molecular dará la posibilidad de prever los sujetos con alto riesgo de LAM, tanto en pacientes con una enfermedad hematológica (PV, TE etc.) como en personas saludables.

50 Gracias por su atención.

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53 Antígenos importantes para el diagnóstico de LAM

54 El triángulo de las Bermudas : lugar de los mieloblastos Dispersión lateral (SSC) Médula ósea normal Intensidad del marcador CD45 Médula ósea con LAM CD45: antígeno universal para células hematológicas

55 Secuenciación masiva de nueva generación (NGS)

56 Secuenciación de próxima generación del ADN de un paciente con LAM con una mutación en el gen IDH2

57 Punción seca un frotis de una biopsia

58 Esquema de la hematopoyesis

59 Lesiones genéticas y cromosómicas en LAM Blood 2016; 127:

60 Las lesiones genéticas y cromosómicas en LAM* ± 50 % de pacientes con LAM no tienen alteraciones cromosómicas Blood 2016; 127:

61 Las lesions genéticas y cromosómicas en LAM ± 50 % de pacientes con LAM no tienen alteraciones cromosómicas Blood 2016; 127:

62 Los procedimientos mas importantes en citología de médula ósea - Preparar los frotis - La tinción - Cómo hacer una fórmula de médula ósea