IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS MECANISMOS DE TUMORIGÉNESIS MEDIADOS POR FRAGMENTOS CARBOXITERMINALES DE HER2

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1 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS MECANISMOS DE TUMORIGÉNESIS MEDIADOS POR FRAGMENTOS CARBOXITERMINALES DE HER2 Investigador principal: Dr. Joaquín V. Arribas López Hospital Universitari Vall d Hebron Duración: 3 años

2 1. Resumen HER2, un receptor de superficie celular acoplado a actividad tirosina quinasa, desempeña un papel causal en la progresión de ciertos cánceres de mama. Tradicionalmente se ha considerado que los receptores HER2 sólo se encuentran asociados a la vía secretora celular. Sin embargo, algunos trabajos recientes han demostrado la existencia de fragmentos de HER2 llamados p95her2, o CTF de HER2, en un subgrupo de pacientes con cáncer de mama con diversas localizaciones subcelulares. Estas variantes de HER2 se encuentran, además de la membrana, en el citosol y en el núcleo celular. El proyecto financiado por La Marató de TV3 se ha dirigido a determinar la posible relevancia de estos fragmentos en la progresión y tratamiento de pacientes con cáncer de mama, así como a identificar los procesos regulados por dichos fragmentos que contribuyen a la progresión tumoral. Para desarrollar el proyecto usamos células que expresaban diferentes mutaciones o deleciones del receptor HER2. Con estas células demostramos que los CTF son generados a partir de dos mecanismos diferentes: procesamiento proteolítico e inicio alternativo de la transducción a partir de metioninas situadas cerca del dominio transmembrana de HER2. Tanto in vitro como in vivo, los CTF generados mediante estos mecanismos se localizaron en la membrana plasmática, el citoplasma o el núcleo celular, validando así el modelo experimental. Seguidamente mostramos que como consecuencia de la expresión de ciertos CTF, a niveles similares a los que se encuentran en tumores, se inducía el crecimiento de xenotrasplantes de tumores de mama en ratones desnudos. Usando este mismo sistema experimental, mostramos que los tumores que expresan CTF no responden a tratamientos basados en anticuerpos contra el dominio extracelular de HER2; sin embargo, estos tumores son sensibles a tratamientos con inhibidores tirosina quinasa dirigidos contra la actividad catalítica del receptor. Así pues, concluimos que 2

3 el dominio quinasa de los CTF de HER2 es necesario para su actividad y que la presencia de estos fragmentos podría tener un papel importante en la resistencia al tratamiento basado en anticuerpos monoclonales. Los resultados que indicaron que los CTF desempeñan un papel crucial en la biología de algunos tumores de mama son paradójicos, debido a que los CTF no tienen el dominio extracelular que, en principio, es el responsable de la dimerización y subsiguiente activación de HER2. Por tanto, sería de esperar que estas formas truncadas fueran inactivas. Para aclarar esta paradoja aparente, caracterizamos individualmente los diferentes CTF y demostramos que mientras que los CTF solubles, tanto citoplasmáticos como nucleares, son inactivos, un determinado fragmento, el CTF-611, es hiperactivo. Este fragmento, con origen de transducción en la metionina 611, se localiza en la membrana plasmática y produce una hiperactivación de diferentes vías de señalización debido a su sorprendente capacidad de homodimerizar de forma constitutiva. Por otra parte, un detallado análisis transcriptómico reveló que el CTF-611 regula la expresión de genes relacionados con mal pronóstico en cáncer de mama. Algunos de estos genes han sido relacionados con metástasis (MET, EPHA2, metaloproteasa de la matriz 1, interleuquina 11, angiopoyetina-like 4, y diferentes integrinas). Finalmente, validamos los resultados obtenidos en modelos animales. Se sabía que los ratones transgénicos que expresan HER2 en la glándula mamaria sólo desarrollan tumores tras la adquisición de mutaciones activadoras en el transgén. Nosotros mostramos que la expresión del CTF- 611 conduce al desarrollo de tumores de mama invasivos y agresivos sin la necesidad de mutaciones. En conjunto, estos resultados mostraron claramente que el CTF-611 es un potente oncogén capaz de promover progresión tumoral y metástasis. 3

4 La continuación de este proyecto ha permitido la generación de herramientas específicas para determinar los niveles del CTF-611 en muestras de pacientes con cáncer de mama. Estas herramientas permitirán, en un futuro próximo, el diseño de terapias más eficaces para el tratamiento de pacientes positivos para HER2. 2. Resultados 1. Identificación del CTF-611 como una forma oncogénica de HER2. El análisis de líneas celulares de cáncer de mama que sobreexpresan HER2 mostró la existencia fragmentos de HER2 generados mediante diferentes mecanismos, como corte proteolítico o inicio alternativo de la transducción (Anido et al., 2006). La caracterización individual de estos fragmentos mostró que uno de ellos, el CTF-611, es una forma hiperactiva de la proteína HER2 in vitro e in vivo (Pedersen et al., 2009) y, además, que promueve la migración celular y su capacidad invasiva (García-Castillo et al., 2009). Por otro lado, este fragmento confiere resistencia al tratamiento con anticuerpos contra el dominio de HER2 utilizado de forma rutinaria para el tratamiento de tumores de mama positivos para HER2. 2. Identificación y caracterización de genes regulados por los CTF de HER2. A partir de un detallado análisis transcriptómico realizado sobre células que expresan el CTF-611, se demostró que esta variante regula la expresión de genes que se encuentran relacionados con peor prognosis en cáncer de mama. Entre ellos se encontraron genes relacionados con metástasis, como el MET, EPHA2, metaloproteasa de la matriz 1, interleuquina 11, angiopoyetina-like 4 y diferentes integrinas. 3. Identificación de proteínas que interaccionan con los CTF de HER2. La identificación, mediante aproximaciones proteómicas, de proteínas que se unen al CTF-611 han confirmado trabajos recientemente publicados que revelan la existencia 4

5 de muchos elementos reguladores de la señalización para HER2 aún desconocidos. Actualmente estamos caracterizando algunos de estos factores identificados en nuestro laboratorio. Los resultados de estos trabajos serán publicados durante este año. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos La identificación del CTF-611 como una forma hiperactiva de HER2 tiene una profunda implicación en la clasificación de los tumores de mama y facilitará el diseño de tratamientos más eficientes para pacientes con cáncer de mama. La clasificación actual de los cánceres de mama depende, en gran parte, de la expresión de HER2. Además de ser un biomarcador crítico, este receptor es la diana de diferentes drogas antitumorales. Las pacientes que sobreexpresan HER2 son actualmente tratadas con terapias basadas en anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio extracelular del receptor o bien con pequeñas moléculas inhibidoras de su actividad tirosina. Con nuestro trabajo hemos demostrado que hay un subgrupo de pacientes positivos para HER2 con mal pronóstico que expresa una colección de fragmentos C-terminales que se conocen de forma colectiva como p95her2 o CTF de HER2. Distintos modelos experimentales mostraron que uno de estos fragmentos, el CTF-611, es una variante oncogénica de HER2. Es más, las pacientes que expresan esta isoforma son resistentes al tratamiento con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio extracelular de HER2 (figura 1). Desafortunadamente, y debido a la falta de herramientas apropiadas para analizar sus niveles de una forma rutinaria en la clínica, la evaluación de CTF-611 como biomarcador no ha podido ser confirmada hasta fechas muy recientes. 5

6 La continuación del proyecto subvencionado por Fundació La Marató de TV3 ha hecho posible desarrollar herramientas para determinar los niveles del CTF-611 en muestras de pacientes con cáncer de mama. Esto nos permitirá una mejor clasificación de los tumores HER2 positivos y ayudará a los oncólogos médicos a elegir el mejor tratamiento posible para este subgrupo de pacientes. Mientras que los pacientes positivos para HER2 y negativos para CTF-611 responden mejor a terapias basadas en el anticuerpo monoclonal, es previsible que las pacientes positivas para HER2 y CTF-611 desarrollen resistencias a los tratamientos con estos anticuerpos, pero en cambio respondan a inhibidores de la actividad tirosina del receptor, como el Lapatinib (Tykerb) (ver figura 2). 4. Publicaciones Anido, J.; Scaltriti, M.; Bech Serra, J. J.; Josefat, B. S.; Rojo Todo, F.; Baselga, J.; Arribas, J. (2006). Biosynthesis of tumorigenic HER2 C-terminal fragments by alternative initiation of translation. Embo J 25, Arribas, J.; Esselens, C. (2009). ADAM17 as a Therapeutic Target in Multiple Diseases. Curr Pharm Des 15, Garcia-Castillo, J.; Pedersen, K.; Angelini, P. D.; Bech-Serra, J. J.; Colome, N.; Cunningham, M. P.; Parra Palau, J. L.; Canals, F.; Baselga, J.; Arribas, J. (2009). HER2 carboxy terminal fragments regulate cell migration and cortactin phosphorylation. J Biol Chem. 6

7 Pedersen, K.; Angelini, P. D.; Laos, S.; Bach-Faig, A.; Cunningham, M. P.; Ferrer-Ramon, C.; Luque-Garcia, A.; Garcia-Castillo, J.; Parra-Palau, J. L.; Scaltriti, M., et al. (2009). A naturally occurring HER2 carboxy-terminal fragment promotes mammary tumor growth and metastasis. Mol Cell Biol 29,