Ejemplo de un Trabajo práctico para la determinación cuantitativa de proteínas (1)

Transcripción

1 Ejemplo de un Trabajo práctico para la determinación cuantitativa de proteínas (1) Objetivos. Al término de la práctica el alumno ha de ser capaz de: 1. Conocer los principales métodos de valoración de las proteínas. 2. Recordar las leyes básicas de absorción de luz para la determinación cuantitativa de compuestos coloreados. 3. Definir los componentes de un espectrofotómetro que permita comprender el manejo del mismo. 4. Construir una recta de calibración con una solución de albúmina de suero bovino como proteína patrón para cada una de los métodos colorimétricos del Biuret y de Lowry. 5. Establecer el desarrollo de los métodos determinando la linealidad, la sensibilidad, el límite de detección y el rango de cada uno de los métodos ensayados. 1. Cuáles son los métodos más usuales de valoración de las proteínas? Existen diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de proteína presente en las muestras biológicas, basados en las propiedades que muestran las proteínas en solución. Los métodos más usuales son: - Reacción del Biuret. - Método de Lowry. - Método de Bradford. - Método del ácido Bicincónico. - Absorción en el ultravioleta. - Métodos inmunológicos. 1 Este apunte fue tomado como ejemplo de la Universidad de Madrid, Facultad de Química página web: (

2 En la práctica se van a ensayar los dos primeros métodos colorimétricos de Biuret y Lowry. En qué consiste la reacción del Biuret? El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. H 2 N CO NH 2 Q H 2 N CO NH CO NH 2 H 2 N CO NH 2 Urea Biuret Reacción del Biuret Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO 4 ) se añade a una solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo de absorción a 540 nm. Las características más importantes de la reacción son: La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas. Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml. No depende de la composición de aminoácidos. Algunos compuestos (NH 4 +, Tris, etc.) dan la reacción. O C C O NH HN O RCH C Cu 2+ H CR C O NH HN RCH H CR Violeta-púrpura Complejo proteína-cu(ii) Cuál es el fundamento del método de Lowry?

3 Para aumentar la sensibilidad de la reacción del biuret, el complejo proteína- Cu 2+ se hace reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteus, dando una coloración azul, con un máximo de absorción a 650 nm. Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico a azul de heteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las proteínas que forman el complejo con el Cu 2+. Las características del método son: La intensidad de la coloración varía con la composición de aminoácidos de la proteína. Es más sensible que el ensayo del biuret. El rango es de 0,1-1 mg/ml. La modificación de Hartree incrementa la sensibilidad de 0,015-0,15 mg/ml. Presenta muchas interferencias. Complejo Proteína-Cu 2+ AA red. Complejo Proteína-Cu 2+ AA oxid. Reactivo Folin oxid. AMARILLO Reactivo Folin red. AZUL Esquema de la reacción de Lowry Qué características poseen otros métodos de valoración de proteínas? Método de Bradford: Consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración azul entre los residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el colorante Azul Coomassie. Absorbe luz a 595 nm. El rango de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5-1,4 mg/ml (ensayo estándar).

4 La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos. Método del ácido Bicincónico. Está basado en la reducción en medio alcalino de Cu(II) a Cu(I) en medio alcalino y la formación de un complejo ácido bicincónico:cu(i), con un máximo de absorbancia a 562 nm. El rango de concentración de proteína es de 0,5-30 mg/ml. Más rápido que el método de Lowry. Altamente preciso y sensible. Absorción en el ultravioleta: Las proteínas poseen una banda de absorción a 280 nm como consecuencia de la absorción de los residuos de tirosilo y triptofanilo en esta región del espectro. Es un método no destructivo. El rango de concentración que se puede determinar depende del contenido de los aminoácidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml. La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias. Métodos inmunológicos: Son métodos altamente específicos, basados en la reacción antígenoanticuerpo. Pueden ser de difusión radial, electrodifusión, precipitación y radioinmunológicos. Pueden alcanzar sensibilidades del orden de ng/ml. 2. Cuáles son las leyes cuantitativas de la absorción de luz? Cuando la luz atraviesa o se refleja en una muestra, la cantidad de luz absorbida es la diferencia entre la radiación incidente (I o ) y la transmitida (I). La

5 cantidad de luz absorbida se expresa normalmente como transmitancia o absorbancia. La transmitancia normalmente se da en términos de una fracción de 1 o como porcentaje, y se define como se indica a continuación: I I T = o %T = x 100 I 0 I 0 La absorbancia A, se define por: A = log 1/T La transmitancia T, se expresa normalmente en el rango de %, pero la absorbancia no tiene unidades y varía de 0 a. Si 100 fotones de luz atraviesan una cubeta y salen por el extremo de la misma sólo 50, la transmitancia es = 0,5 o del 50 %. Si los 50 fotones atraviesan una cubeta de las mismas dimensiones, sólo saldrán 25, y así sucesivamente. Este efecto fue formulado como ecuación matemática por Bouguer (1729) y Lambert (1760) según: I T = = e -k b I 0 Ley de Bouguer-Lambert donde k es una constante y b es el paso óptico, normalmente en centímetros. La ley de Beer es idéntica a la de Bouguer, excepto que está expresada en términos de concentración. Establece que la absorbancia es proporcional al número de moléculas absorbentes por las que pasa la luz. Combinando las dos leyes se obtiene la ley de Beer-Bouguer-Lambert.

6 Ley de Buoguer-Lambert Ley de Beer-Bouguer-Lambert T = I/I 0 = e -k b c donde c es la concentración de las especies absorbentes, expresada normalmente en gramos por litro o miligramos por litro. Esta ecuación puede transformarse en una expresión lineal tomando el logaritmo, que se expresa en la forma: A = -log T = -log(i/i 0 ) = log(i 0 /I) = e b c donde e es la absortividad molar o coeficiente de extinción para la sustancia absorbente. El coeficiente de extinción molar (e): Es característico de una sustancia en condiciones definidas de longitud de onda, solvente y temperatura. Tiene las unidades de M -1 x cm -1. A veces, este coeficiente también se suele expresar como la extinción de una muestra cuyo camino óptico es de 1 cm y cuya concentración es del 1 % o de 1 mg/ml. También depende de las características del instrumento utilizado. Por esta razón, normalmente no se utilizan valores predeterminados del coeficiente de extinción para análisis cuantitativo. En su lugar, se construye una curva de calibración para la sustancia a analizar, utilizando una solución patrón con concentraciones conocidas de analito. 3. Qué instrumentación se utiliza para construir la curva de calibración?

7 Un espectrofotómetro es un instrumento para medir la transmitancia o absorbancia de una muestra, en función de la longitud de onda de la radiación electromagnética. Un espectrofotómetro consta de los siguientes componentes clave: Una fuente que genera una banda ancha de radiación electromagnética: Puede ser una lámpara halógena o de volframio que suministra la luz de la zona visible del espectro ( nm), o de neón, argón o de hidrógeno, para la zona ultravioleta ( nm). Un dispositivo de dispersión que selecciona una longitud de onda particular de la radiación de la fuente. Comúnmente, se utilizan prismas y redes holográficas de difracción, que junto a una rendija de entrada y otra de salida configuran el monocromador. Un área de muestra: Célula transparente a la radiación incidente monocromática que contiene el material bajo estudio disuelto en un solvente adecuado. Suele ser de 1 cm de espesor. Uno o más detectores para medir la intensidad de la radiación: Normalmente, es un tubo fotomultiplicador o un tubo fotodiodo. Los espectrofotómetros pueden ser de distintos tipos: De haz simple. De doble haz. Con división de haz. De doble longitud de onda. El espectrofotómetro que se va a manejar en la práctica es del tipo convencional de haz simple. Un esquema del mismo se presenta a continuación: Esquema de un espectrofotómetro convencional de haz simple El camino de la radiación electromagnética es el siguiente: La luz policromática de la fuente se enfoca sobre la rendija de entrada de un monocromador. Este transmite selectivamente una estrecha banda de luz a través de la rendija de salida. Esta luz atraviesa el área de muestra hasta el detector. La absorbancia de la muestra se determina midiendo la intensidad de luz que alcanza el detector cuando no hay muestra (el blanco de reactivo, que contiene todos los reactivos menos la sustancia a determinar) y se

8 compara con la intensidad de la luz que alcanza el detector después de atravesar la muestra. 4. Cómo se construye una recta de calibración? Antes de comenzar a construir la recta de calibración es imprescindible: Conocer la composición y naturaleza química de los reactivos que se manejan. Se debe poner atención a su carácter ácido, básico, oxidante, reductor, etc., y especialmente a su toxicidad. Practicar la medida de volúmenes con las micropipetas. Para ello, en primer lugar, se leen las normas de uso de las micropipetas automáticas. A continuación, la mejor manera de conseguir una seguridad y confianza en sí mismo en el uso de las micropipetas es la de ensayar previamente la medida de distintos volúmenes de agua destilada. Las curvas de calibración que se obtengan confirmarán si ha alcanzado la práctica necesaria. Saber utilizar un agitatubos. Todas las reacciones químicas se producen cuando las moléculas entran en contacto, cuestión que se consigue mezclando perfectamente los reactantes mediante agitación. El agitatubos realiza esa función con un movimiento vibratorio del tubo de ensayo en el que se vierten las soluciones. El movimiento puede o no regularse en intensidad, y activarse o no por contacto directo del tubo con el adapta-tubos del agitador. Un par de segundos de agitación con un buen torbellino es suficiente para mezclar bien las soluciones. Las precauciones a tener en cuenta son: * Controlar la intensidad de agitación. Si el volumen de líquido en el tubo supera más de la mitad de su capacidad, su contenido puede proyectarse al exterior. * No dirigir el tubo hacia las personas. Si el líquido es corrosivo, inflamable. tóxico, etc., puede provocar un accidente. Manejar el espectrofotómetro: Las etapas son: 1) El espectrofotómetro debe de encenderse al menos media hora antes de hacer una medición. Se comprueba que el aparato da una señal estable de ajuste del cero de absorbancia. 2) Se selecciona la longitud de onda del máximo de absorción del compuesto a medir con el mando correspondiente. 3) Se selecciona la opción de medir en absorbancia. 4) Se toma una cubeta de plástico de 3 ml, procurando cogerla de manera que no se manchen las paredes de la cubeta que se expongan al haz de luz del espectrofotómetro.

9 5) Se vierte en la cubeta un volumen de la solución del blanco reactivo tal que ocupe las tres cuartas partes del volumen de la cubeta (~ 2,5 ml). 6) Se coloca la cubeta en el compartimento de cubetas del espectrofotómetro, procurando que las paredes lisas de la misma se coloquen en la dirección del haz de luz del espectrofotómetro. 7) Se realiza el ajuste del cero de absorbancia. Este mando no se debe de tocar en las posteriores etapas. 8) Se saca la cubeta y se devuelve la solución blanco a su correspondiente tubo de ensayo, procurando que en la cubeta no queden gotas (no es necesario secarla). 9) Se vierte en la misma cubeta la solución que contenga la muestra problema. 10) Se introduce la cubeta en el compartimento de muestra del espectrofotómetro. 11) Se mide la absorbancia de la solución de muestra problema. Obtención de la recta de calibración de la reacción del Biuret. Se colocan en una gradilla ocho tubos de ensayo que deben de estar limpios y secos. Se numeran del 1 al 8 con un rotulador permanente al agua. Con las micropipetas adecuadas al volumen a medir, se adiciona a cada uno de ellos los volúmenes de la disolución patrón de albúmina de suero bovino (BSA) y de agua destilada que se indican en la siguiente Tabla:

10 Tubo (nº) Albúmina patrón (ml) Agua (ml) 1 0 2,0 2 0,2 1,8 3 0,4 1,6 4 0,6 1,4 5 0,8 1,2 6 1,0 1,0 7 1,2 0,8 8 1,4 0,6 Se agita bien cada uno de los tubos de ensayo con el agitatubos. A cada uno de los tubos de ensayo se añaden 3 ml de reactivo de Biuret. Se vuelven a agitar con el agitatubos cada uno de los tubos de ensayo. Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el baño de agua termostatizado a 37 ºC, dejándose que se desarrolle el color durante 15 min. Se enfrían los tubos de ensayo, introduciendo la gradilla en el agua a temperatura ambiente contenida en el vaso del fregador. Un par de minutos es suficiente.

11 Se sacan del fregador y se procede a medir en el espectrofotómetro siguiendo las normas expresadas anteriormente. Se ajusta el mando de selección de la longitud de onda del espectrofotómetro a 540 nm. Se ajusta el cero de absorbancia con la solución blanco exenta de proteína (tubo 1). Se miden las absorbancias de los tubos 2 a 8. Siempre que se realicen las medidas desde la solución menos concentrada (tubo 2) a la más concentrada (tubo 8), se cometerá el mismo error de medida, por lo que no será necesario enjuagar y secar la cubeta después de cada medición. Se anotan las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio.

12 Una vez realizadas las medidas, se limpian cada uno de los tubos de ensayo con escobilla y jabón. Las marcas de rotulador se eliminan fácilmente por frotación con el estropajo. Se lava con abundante agua del grifo y se enjuagan los tubos con agua destilada. Se dejan en la gradilla boca abajo hasta el día siguiente para que se sequen. Obtención de la recta de calibración del método de Lowry. Puesto que el método de Lowry es más sensible que la reacción del Biuret, lo primero que hay que realizar es la preparación de una solución de proteína patrón más diluida. A partir de la solución de BSA de 10 mg/ml, que se ha utilizado en la reacción del Biuret hay que preparar una solución de BSA de 0,2 mg/ml en agua. Para ello se siguen la siguientes etapas: 1. Se rotula un tubo de ensayo de 10 ml con BSA 0,2. 2. Con una micropipeta se miden 200 ml de la solución de BSA de 10 mg/ml y se vierten en el tubo de ensayo rotulado. 3. Con una pipeta de 10 ml, se añaden 9,8 ml de agua destilada al tubo de ensayo. 4. Se toma una porción de papel de Parafilm, se quita el plástico que la recubre y por la parte que estaba protegida, se tapa el tubo de ensayo, agitándose varias veces por inversión suave del tubo. Es importante que se consiga una dilución homogénea de la solución proteica. Para obtener la recta de calibración del método de Lowry se siguen los siguientes pasos: Se colocan en una gradilla siete tubos de ensayo que deben de estar limpios y secos. Se numeran del 1 al 7 con un rotulador permanente al agua. Con las micropipetas adecuadas al volumen a medir, se adiciona a cada uno de ellos los volúmenes de la solución patrón de BSA 0,2 y de agua destilada que se indican en la siguiente Tabla:

13 Tubo BSA 0,2 Agua (nº) (ml) (ml) 1 0 1,0 2 0,1 0,9 3 0,2 0,8 4 0,3 0,7 5 0,5 0,5 6 0,7 0,3 7 0,9 0,1 Se agita bien cada uno de los tubos de ensayo con el agitatubos. A cada uno de los tubos de ensayo se añaden 0,9 ml de reactivo A. Se vuelven a agitar con el agitatubos cada uno de los tubos de ensayo. Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el baño de agua termostatizado a 50 ºC, dejándose en el baño durante 15 min. Se enfrían los tubos de ensayo, introduciendo la gradilla en el agua a temperatura ambiente contenida en el vaso del fregador. Unos tres minutos es suficiente. Se sacan del fregador y se adicionan 0,1 ml de reactivo B. Se vuelven a agitar con el agitatubos cada uno de los tubos de ensayo. Se introduce la gradilla con los tubos de ensayo en el baño de agua termostatizado a 37 ºC y se dejan reaccionar durante 5 min. A continuación, se añaden 3 ml de reactivo C. Se vuelven a agitar con el agitatubos cada uno de los tubos de ensayo. Se calientan los tubos de ensayo a 50 ºC durante 10 min. Se enfrían los tubos de ensayo antes de proceder a medir en el espectrofotó-metro siguiendo las normas expresadas anteriormente. Se ajusta el mando de selección de la longitud de onda del espectrofotómetro a 650 nm. Se ajusta el cero de absorbancia con la solución blanco exenta de proteína (tubo 1). Se miden las absorbancias de los tubos 2 a 7. Siempre que se realicen las medidas desde la solución menos concentrada (tubo 2) a la más concentrada (tubo 7), se cometerá el mismo error de medida, por lo que no será necesario enjuagar y secar la cubeta después de cada medición. Se anotan las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio. Una vez realizadas las medidas, se limpian cada uno de los tubos de ensayo con escobilla y jabón. Las marcas de rotulador se eliminan

14 fácilmente por frotación con el estropajo. Se lava con abundante agua del grifo y se enjuagan los tubos con agua destilada. Se dejan en la gradilla boca abajo hasta el día siguiente para que se sequen. 5. Qué es desarrollar un método cuantitativo? Una vez determinados los valores de absorbancia para cada concentración de proteína patrón para los métodos establecidos de Biuret y Lowry, el desarrollo de los mismos pasa por optimizar una serie de parámetros, tales como, linealidad, sensibilidad, precisión, exactitud, rango, selectividad y robustez, mediante el uso de herramientas estadísticas. Veamos los parámetros que se van a determinar en la práctica. Qué es la Linealidad? La linealidad es la capacidad del método para producir resultados proporcionales, directamente o mediante una transformación matemática, a la concentración del analito en las muestras, dentro de un determinado rango. En las medidas de UV-visible, la relación más usual es la ley de Ley de Beer-Bouguer-Lambert. Una curva de calibración lineal que relacione la absorbancia con la concentración debe de tener la forma: A = k C donde A es la absorbancia, C es la concentración y k es el factor de calibración (la pendiente de la curva de calibración). Absorbancia (A) Rango de linealidad A C Concentración (C) Recta de calibrado Absorbancia vs. Concentración de analito. Teóricamente solo se requiere la medida de absorbancia de un patrón de concentración conocida, como calibrado para la cuantificación.

15 Sin embargo, en la práctica se pueden causar desviaciones de la Ley de Beer en función de parámetros instrumentales y de la muestra, y que pueden resultar en errores cuantitativos significativos si la curva de calibración no está caracterizada con exactitud. Errores de una calibración inadecuada Para construir una curva de calibración, las concentraciones de los patrones deben de abarcar el rango de concentración esperado de las muestras de análisis. Todos los valores patrón medidos deben estar sobre una línea recta, pero en la práctica, los valores siempre presentan cierta dispersión. Se debe de aplicar un método estadístico para encontrar el mejor ajuste de los datos a la curva de calibración. El método estadístico más frecuente es la regresión lineal, conocido como el método de mínimos cuadrados. Curvas de calibración Para comparar dos curvas de calibración, se requiere medir la bondad del ajuste de los patrones, De los valores estadísticos el coeficiente de correlación es el más popular. Un valor de +1 indica una relación lineal perfecta entre la absorbancia y la concentración. Qué es la Sensibilidad?

16 La sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida para una determinada cantidad de analito. Se puede determinar por la pendiente de la recta de calibración ajustada por mínimos cuadrados. Coincide con el valor del coeficiente de extinción: e = A/ c. También se indica mediante dos factores analíticos: El límite de detección (LOD). El límite de cuantificación (LOQ). Qué es el Límite de Detección (LOD)? El LOD es la concentración más baja del analito que se puede detectar pero no necesariamente cuantificar. En general, el LOD es el punto al que la señal del analito es igual a tres veces el ruido de la medida. Para algunos espectrofotómetros se puede establecer que el LOD es, aproximadamente, tres veces la desviación estándar. Qué es el Límite de Cuantificación (LOQ)? El LOQ es la concentración más baja del analito que se puede determinar con una precisión y exactitud aceptables. Para calcular el LOQ se deben de definir por tanto los límites aceptables de precisión y exactitud. Se puede aproximar a la relación entre la precisión de la medida analítica y la sensibilidad del método. Qué es el Rango? Rango es el intervalo entre los niveles superior e inferior del analito, que se han calculado con la precisión, exactitud y linealidad requeridos. Rango de linealidad será por tanto el intervalo entre las concentraciones más baja y más alta de analito determinadas, para las cuales se cumple la ley de Beer-Lambert. Qué hay que realizar para desarrollar los métodos de Biuret y Lowry?

17 Las etapas recomendables que hay que realizar para cada uno de los métodos son: Se calcula la concentración de proteína que se ha colocado en cada uno de los tubos de ensayo. Como ejemplo: en el ensayo de Biuret, en el tubo 2 se han colocado 0,2 ml de BSA 10 mg/ml y se han diluido a un volumen de 2 ml con agua. Por tanto la concentración de proteína en el tubo será: (0,2 ml x 10 mg/ml) : 2 ml = 1 mg/ml En papel milimetrado, se representan los valores experimentales de absorbancia obtenidos frente a la concentración de proteína estándar calculada de cada uno de los tubos, para cada método ensayado. Se ajustan los puntos obtenidos por el método de mínimos cuadrados a una recta, incluyendo el punto 0,0. Se representan las rectas ajustadas en el papel milimetrado. Se desprecian los puntos que se desvíen de la linealidad en un 5 % (intervalo de confianza del 95%). Para ello, la absorbancia experimental correspondiente a una determinada concentración se compara con el valor de absorbancia calculado mediante la ecuación de la recta ajustada, y si posee un valor superior al 5 % de desviación se desprecia. Si se ha despreciado algún punto, se repite el proceso de ajuste, representación y desviación para cada recta. En el cuaderno de Prácticas debe de quedar reflejada la representación gráfica de todos los puntos experimentales obtenidos, junto con los de la recta final ajustada por mínimos cuadrados, indicando los puntos despreciados. Igualmente se deben de expresar las ecuaciones de las rectas ajustadas junto con los valores de los coeficientes de correlación con cuatro dígitos como máximo. Las pendientes de cada una de las rectas son las sensibilidades de cada uno de los métodos, y sus valores también son los correspondientes coeficientes de absorción de los complejos proteína-reactivo. Se determinan los límites de detección y de cuantificación para cada uno de los métodos, teniendo en cuenta que en los espectrofotómetros con lectura digital, las medidas de absorbancia se realizan con una precisión de 0,001. Igualmente, los rangos de linealidad, en el cual la respuesta de cada uno de los métodos es lineal, vendrán dados por los intervalos comprendidos entre el límite de cuantificación y el valor de concentración más alta que cumple la ley de Beer.

18 Qué protocolo habría que utilizar para determinar la concentración de proteína de una muestra desconocida? Una vez obtenida la recta de calibrado, si se deseara conocer la concentración de proteína de una muestra problema, se debe seguir el mismo procedimiento descrito en el apartado 4 para cada uno de los métodos, pero tomando 2 ml de la muestra problema en el caso del método del Biuret, ó 1 ml para el método de Lowry. Si la absorbancia de la muestra está dentro del rango de medida del método seleccionado, mediante la ecuación de la recta de calibrado se puede calcular la concentración de proteína de la disolución problema. Si la absorbancia es mayor al límite superior del rango de medida, siempre se puede realizar la dilución correspondiente para introducirla en el rango del método. Pero si es inferior al límite de cuantificación del método seleccionado, hay que emplear un método más sensible.