Cómo clasificar hoy en día las Leucemias y los Linfomas? El rol de la citometría de flujo. SANDRA QUIJANO GÓMEZ MSc. PhD.
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- Lidia Redondo Roldán
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1 Cómo clasificar hoy en día las Leucemias y los Linfomas? El rol de la citometría de flujo SANDRA QUIJANO GÓMEZ MSc. PhD. Octubre de 2011
2 SÍNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS B (SLPC-B) Expansiones (mono)clonales de linfocitos B maduros clínicamente heterogéneas CLASIFICACIÓN DE LOS SLPC-B SEGÚN LA OMS Leucemias linfoides crónicas de células B maduras/periféricas: Leucemia linfática crónica/linfoma linfocítico de célula B pequeña Leucemia prolinfocítica Tricoleucemia Linfomas de células B maduras/periféricos: Linfoma linfoplasmocítico Linfoma de la zona marginal esplénica Linfoma de la zona marginal extranodal tipo MALT Linfoma de la zona marginal nodal (células B monocitoides) Linfoma folicular Linfoma de células del manto Linfoma B difuso de célula grande Linfoma de Burkitt Neoplasias de células plasmáticas: Mieloma múltiple/plasmocitoma Campo E. et al. Blood 2011
3 SLPC-B: ANOMALÍAS QUE AFECTAN A GENES DE CONTROL DE CICLO CELULAR Y DE LA APOPTOSIS SLPC-B Gen Función Alteración Frecuencia LF BCL2 Inhibición de apoptosis t(14;18) 80%-90% MALT BCL10 Inhibición de apoptosis t(1;14) <5% API2/MLT1 a través de NFκB t(11;18) 30%-50% MALT1 t(14;18) 20% FOXP1 Factor de transcripción t(3;14) 10%-50% regulador de desarrollo B LCM CICLINA D1 Ciclo celular (transición G1/S) t(11;14) >90% LLC-B RB/D13S25 del(13q) 10%-60% ATM/MLL Control del ciclo celular del(11q) 5%-15% P53 del(17p) 1%-5% MDM2? %-25% LLP PAX5 Diferenciación B t(9;14) 50% MW BLIMP1 Diferenciación B Ciclo celular (arresto G0/G1) del(6q21) 30%-50% LBDCG BCL6 Activación y diferenciación B t(3q27) 30%-40% C-MYC Control del ciclo celular t(8;14) 5%-10% BCL-2 Inhibición de apoptosis t(14;18) 30%-40% LB C-MYC Diferenciación t(8;14) 80% Control del ciclo celular t(8;22) 5% Inducción de apoptosis t(2;8) 15% Küppers R. Nat Rev Cancer 2005 Quijano S et al. Blood Campo E. et al. Blood 2011
4 MECANISMOS DE TRANSFORMACIÓN MALIGNA DE CÉLULAS B DE CENTRO GERMINAL EN SLPC-B Célula B del CG Centro germinal (CG) DC foliculares B T Linfoplasmocito Célula plasmática Mecanismos oncogénicos C-MYC NFκB BCL2 Apoptosis BCL-6 PAX5 BCL6 *Anomalías adicionales de P53, RB, P16, P27, ATM MAYOR AGRESIVIDAD TUMORAL Y VENTAJA PROLIFERATIVA Küppers R. Nat Rev Cancer 2005
5 Alteraciones genéticas en Leucemias agudas 60-80% de los casos presentan alteraciones cromosómicas estructurales y/ó numéricas *Pronóstico: buen pronóstico -t(12;21) e hiperdiploidia (51-65 cromosomas) mal pronóstico -t(9;22); t(4;11), t(1,19) e hipodiploidia-. * Implicadas en proceso de transformación maligna, activación de vías mitógenas, inhibición de la apoptosis y la respuesta inmune anti-tumoral. Van Dongen et al, Lancet Onciu M. Hematol Oncol Clin N Am. 2009
6 Malignidades hematológicas: APLICACIONES CLINICAS DEL INMUNOFENOTIPO Diagnóstico: identificación de células neoplásicas (presencia vs ausencia) Clasificación: identificación de línea, estadio madurativo, screening de alteraciones cromosómicas Evaluación Pronóstica Monitorización del tratamiento
7 Caracterización inmunofenotípica de células tumorales por citometría de flujo EN QUE SE PARECEN LAS CELULAS LEUCEMICAS A LAS CELULAS NORMALES? - Reflejan línea celular y estadio madurativo. EN QUE SE DIFERENCIAN LAS CELULAS LEUCEMICAS DE LAS CELULAS NORMALES? - Reflejan distintos patrones de expresión de proteínas (alteraciones genéticas)
8 La interpretación adecuada de neoplasias hematológicas requiere el CONOCIMIENTO del Inmunofenotipo de MUESTRAS NORMALES Van Lochem. et al. Clinical Cytometry 2004 Wood B. et al. Clinical Cytometry 2007 Pérez de Andrés M. et al. Clinical Cytometry Saavedra, C., Quijano S, Orfao A. et al. Biomédica 2010
9 Inmunofenotipo de poblaciones B de Médula Ósea normal: Citometría de flujo de 4 fluorescencias Clinical Cytometry 2004
10 Inmunofenotipo de poblaciones B de Médula Ósea normal: Citometría de flujo de 4 fluorescencias Selección de células CD19+ Pre-pre B Pre-B Célula B inmadura Célula B madura Van Lochem. et al. Clinical Cytometry 2004
11 Inmunofenotipo de células B de distintos tejidos normales Clinical Cytometry 2010
12 Inmunofenotipo de células B de distintos tejidos normales Citometría de flujo de 6-8 fluorescencias B inmaduras B maduras B maduras SP= 614 individuos sanos años B inmaduras Pre-B II Pre-B I Plasmablastos Plasmáticas B memoria Plasmablastos PB B memoria Plasmablastos B centro germinal B vírgenes B vírgenes B inmaduras Pérez de Andrés et al. Clinical Cytometry 2010
13 Población de estudio: 10 muestras de MO de individuos años
14 OBJETIVOS 1. Cuantificar distintas subpoblaciones celulares hematopoyéticas de MO normal en términos absolutos y relativos. 2. Analizar la expresión de diferentes marcadores celulares cuya reactividad está asociada a la diferenciación linfoide y mieloide, con el fin de establecer rangos de expresión para los mismos. 3. Utilizar estos resultados como parámetros de análisis para el diagnóstico y clasificación de las leucemias mieloides agudas y síndromes mielodisplásicos que se estudien en la Unidad de Citometría del Hospital Universitario San Ignacio.
15 Análisis de muestras de MO mediante citometría de flujo EDTA Muestras de MO disgregadas (aprox. 5 ml) Pasadas por jeringa (diámetro X) 100 ul muestra Marcaje celular FITC PE PERCP APC ESFERAS cytdt cympo CD45 CD34 + CD34 CD11b CD45 CD34 + HLA-DR CD117 CD45 CD34 + CD64 CD14 CD45 CD34 + CD71 CD36 CD45 CD34 + CD15 CD16 CD33 CD34 + Adquisición y análisis en el Citómetro de flujo FACSCalibur BDB Programas informáticos CellQuest Pro y Paint A Gate BDB
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17 Análisis de precursores CD34+ Precursores mieloides Precursores linfoides
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19 Malignidades hematológicas: APLICACIONES CLINICAS DEL INMUNOFENOTIPO Diagnóstico: identificación de células neoplásicas (presencia vs ausencia) Clasificación: identificación de línea, estadio madurativo, screening de alteraciones cromosómicas Evaluación Pronóstica Monitorización del tratamiento
20 LLA-B Momento del Diagnóstico (90% de linfoblastos) FRECUENCIA ELEVADA CELULAS INMADURAS LINEA B FSC-A -> _CD20,2f,CD10#ABF.fcs CD34 PE-A -> _CD20,2f,CD10#ABF.fcs CD19 FITC-A -> _CD20,2f,CD10#ABF.fcs HEMATOPOYETICAS CELULAS INMADURAS MARCADORES ABERRANTES CD45 PerCP-A -> _CD20,2f,CD10#ABF.fcs CD10 APC-A -> _CD20,2f,CD10#ABF.fcs CD38 PE-Cy7-A -> _CD20,2f,CD10#ABF.fcs
21 SPLC-B: fenotipo normal vs aberrante Célula B normal Células B aberrantes Tricoleucemia LLC-B Tricoleucemia Tricoleucemia
22 Malignidades hematológicas: APLICACIONES CLINICAS DEL INMUNOFENOTIPO Diagnóstico: identificación de células neoplásicas (presencia vs ausencia) Clasificación: identificación de línea, estadio madurativo, screening de alteraciones cromosómicas Evaluación Pronóstica Monitorización del tratamiento
23 Clinical Cytometry 2004
24 Leucemia Promielocítica Aguda: INMUNOFENOTIPO DE CASO t(15;17) + SSC-A SSC-A CD33++ SSC-A CD117-/ > MO_MUESTRA.fcs PerCP-Cy5-5-A -> MO_MUESTRA.fcs APC-A -> FSC-A MO_MUESTRA.fcs CD33 PERCPCY5.5 CD117 APC Promielocito normal CD15+ Promielocito aberrante CD15+ débil
25 Clinical Cytometry 2004
26 LLA-B: INMUNOFENOTIPO DE CASO BCR/ABL + CD19 CD19 CD45 CD > -> -> -> CD10 RFR CD13 RFR CD34 CD34 RFR RFR CD19++,CD13+, CD45-/+, CD20-/+
27 FENOTIPO Y ALTERACIONES GENÉTICAS EN LLC-B 13qtrisomía 12 11q- 17p- CD20 FMC7 CD24 CD19 FSC SSC Marcador CD27 CD25 CD22 sigm sig CD79b CD38 CD11c CD23 CD43 CD5 bcl2 n= 180 pacientes Grupo A (n=38) Alteración genética % +12 Grupo fenotípico A B C 11% 37% 46% % -13q 78% 43% 33% Pacientes Grupo B (n=19) % -11q % -17p Fenotipo 5% 5% CD38 - CD79b -/d sig -/d 5% 5% 18% 3% FMC7 - CD38 + CD23 - CD20 + FMC7 + sig + CD79b + Grupo C (n=33) Quijano S et al. Clinical Cytometry. 2008
28 Expresión de Zap70 en LLC-B por citometría de flujo Casos ZAP70+: - Peor pronóstico - Ausencia de mutaciones genes IGVH (fenotipo de linfocito B virgen) -Trisomía 12 - Asociado a estadios avanzados LLC-B NEGATIVA CD3 PercP LINFOCITOS T Zap70 PE CELULAS B TUMORALES CD3 PercP LINFOCITOS T Zap70 PE CELULAS B TUMORALES LLC-B POSITIVA Zap70 PE Zap70 PE Inmunohistoquímica Crespo M et al. N Engl J Med 2003 Carreras J et al. J of Pathol 2005 Lanasa M. Hematology 2010 Rivkina A et al. Exp Oncol 2011
29 Análisis del ciclo celular en neoplasias hematológicas por citometría de flujo - La tasa proliferativa y la aneuploidia de ADN se asocian con la agresividad tumoral y son factores pronósticos independientes. - Identifican grupos de pacientes con mayor riesgo de transformación a variantes más agresivas de la enfermedad. - Las leucemias y linfomas muestran una tasa proliferativa muy heterogénea que, puede reflejar la de su contrapartida madurativa normal y que varía según la alteración genética asociada y el microambiente celular. Quijano S et al. Clinical Cytometry Quijano S et al. Blood. 2008
30 ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR: - Muestras control: MO (n=10): CD45/CD19/DRAQ5 CD38/CD19/DRAQ5 SP (n=5): CD20/CD23/DRAQ5 GGLL (n=5): CD38/CD20/DRAQ5 CD23-PE CD20-FITC No de eventos %S+G2/M= 0.1% Cantidad de ADN - Linfomas B (n = 432 pacientes): Kit Cycloscope-NHL (Cytognos; Salamanca) CD19/CD20/CD22/CD23-FITC + Yorudo de propidiop (IP) Quijano S et al. Blood SSC No de eventos CD19/20/22/23 FITC %S+G2/M= 18% Cantidad de ADN
31 TASA PROLIFERATIVA DE LAS CÉLULAS B NORMALES A LO LARGO DE LA DIFERENCIACIÓN B MO SP GGLL MO 30% 25% * % de células en fase S+G2/M 20% 15% 10% 5% 0% * * * * * * * *p<0.05 CD45 lo CD19 lo CD45 + CD19 hi Precursores B CD45 hi CD20 + CD20 + CD19 + CD23 + CD23 - Linfocitos B maduros CD38 lo CD20 + CD38 + CD20 hi CD38 hi CD20 lo CD38 hi CD19 + Células Plasmáticas Quijano S, et al. Blood Quijano S, et al. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2008.
32 TASA PROLIFERATIVA DE LOS LINFOMAS B VS SU CONTRAPARTIDA NORMAL fase S+G2/M 50% 40% 30% 20% MON: Linfocitos B CD45 hi CD19 + SPN: Células B CD20 + CD23 + GL: Células B CD38 lo CD20 + * GL: Células B CD38 + CD20 hi * ** * CP normales de MO y GL % de células en 10% 74% 60% * * * * 16% 37% 16% 50% ** 0% 93% 21% 83% LLC-B (MO) LLC-B (SP) LZME TL LCM (MO/SP) LCM (GL) MALT LF LBDCG LB LLP/MW *Fase S+G2/M significativamente elevada **Fase S+G2/M significativamente disminuida
33 LINFOMAS B: FRECUENCIA DE LAS ALTERACIONES GENÉTICAS ANALIZADAS % de casos aneuploides 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 5% 21% 10% 18% 42% 29% 6% LLC-B LCM MALT LF LBDCG LB LLP/MW % de casos alterados 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 37% 13q- LLC-B MALT LF LB LCM 77% 86% 93% LBDCG LLP/MW 25% 38% 30% 22% 9% 7% 8% q- 17p- t(11;14) t(14q32) t(14;18) t(3q27) t(8;14) 6q21- t(14q32)
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36 Ploidia de ADN en pacientes pediátricos con LLA-B * n=14 n=30 LLA-B Indice de ADN Media ± DS Rango P Diploides 0,94 ± 0,02 0,94-1 <0,001 Hiperdiploides 1,15 ± 0,2 1,01-1,9 Quijano S, Saavedra C et al. Artículo en preparación 2011.
37 Tasa proliferativa de blastos en pacientes pediátricos con LLA-B * * * * n=7 n=44 * Quijano S, Saavedra C et al. Artículo en preparación 2011.
38 Malignidades hematológicas: APLICACIONES CLINICAS DEL INMUNOFENOTIPO Diagnóstico: identificación de células neoplásicas (presencia vs ausencia) Clasificación: identificación de línea, estadio madurativo, screening de alteraciones cromosómicas Evaluación Pronóstica Monitorización del tratamiento
39 ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL *Realizados con técnicas altamente sensibles: Biología molecular y citometría de flujo Leucemia Mieloide Aguda PCR cuantitativa (RQ-PCR): -Detección de WT1, FLT3, AML1-ETO, CBFbeta/MYH11 en casos con t(8;21) e inv(16): identificación de pacientes con alto riesgo de recaída. -Sensibilidad: 0.1%-0.001% (1/1000-1/ ) (leucémicas/normales) Citometría de Flujo: *fenotipos anormales: 75-85% de los casos - Sensibilidad: puede variar según las aberraciones fenotípicas detectadas al diagnóstico % de células residuales posttratamiento (15 días) Probabilidad de recaída <0.01% Baja 0.01%-0.1% 0.1%-1% Intermedia >1% Alta (84%) San Miguel JF et al. Blood Shook D et al. Clin Lymphoma Myeloma 2009.
40 Leucemia Linfoide Aguda ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL Citometría de Flujo: *Requiere conocimiento de perfiles fenotípicos de MO y SP en condiciones normales y EXPERIENCIA en el análisis de clones y selección de los marcadores adecuados - Muy útil en fases pre y post-trasplante de células stem. -Sensibilidad: puede variar según las aberraciones fenotípicas detectadas al diagnóstico - Límite de positividad: 0.01% PCR cuantitativa (RQ-PCR): -Detección de BCR-ABL, MLLAF4, E2A-PBX1 y TEL-AML1 con sensibilidad: 0.1%-0.001% (1/1000-1/ ) (leucémicas/normales) Adultos LLA-B % de células residuales posttratamiento Días 11 y 24 <0.01% Probabilidad de recaída (durante 3 años) Bruggemann M. Blood 2006 Hasta la semana 16: 0.01% >0.01% 47% 94% Campana D. Semin Hematol %
41 Tipo de muestra I Consenso Colombiano de Citometría: Manejo de muestras para estudios inmunofenotípicos Tiempo* Lavados Estabilizantes Centrifugación Anticoagulantes Solución salina/pbs estéril para transporte Hasta 24 Si No Si EDTA, Heparina No horas Si No Si EDTA, Heparina No Sangre periférica** Médula Ósea Hasta 24 horas Sangre de Hasta 24 No No No EDTA, Heparina No cordón horas umbilical + Productos de Hasta 24 No No No EDTA, Heparina No leucaféresis horas Biopsias de 60 minutos Si No Si No Si tejidos sólidos** Punciones de 60 minutos Si No Si No Si tejidos sólidos Temperatura (PAAF)** Líquido 30 minutos Si Si*** Si (máximo dos EDTA No cefalorraquídeo (sin pasos) (LCR) estabilizar) Otros fluidos corporales** 60 minutos Si Si Si EDTA Si *Tiempo máximo comprendido entre la obtención, transporte, y procesamiento de la muestra. **Las muestras pueden ser estabilizadas si se requieren confirmar estudios posteriores. ***El empleo de una solución estabilizante previene la pérdida celular por periodos de tiempo superiores a las horas de su obtención. +: Viabilidad celular Saavedra, C., Quijano S, Orfao A. et al. Biomédica 2010
42 Rastreo diagnóstico de meningitis neoplásica por citometría de flujo El manejo de muestras de LCR requiere unas condiciones especiales de almacenamiento, transporte, preparación y marcaje. Kraan J et al. Current Protocols Cytometry 2008 Fase pre-analítica Muestras de LCR estabilizadas (Transfix, Immunostep SL) EDTA Previene pérdida celular por periodos Superiores a 24-48horas (MO y SP) LCR: mantiene celularidad >10d a 2-8 C Canonico B et al. J Immunol Methods 2004 Quijano S et al. J. Clin Oncol Quijano S et al. Eur. J. Hematol Kraan J et al. Current Protocols Cytometry 2008
43 DETECCIÓN DE INFILTRACIÓN DE SNC EN LNH-B AGRESIVO: CMF versus Citología (n=123) Infiltración CMF Citología P de LCR 27/123 (22%) 7/123 (6%) <0, % 75% 50% Positivos Negativos 25% 0% CMF Citología Quijano S et al. J. Clin. Oncol. 2009; 27(9):
44 FRECUENCIA DE CÉLULAS B NEOPLÁSICAS EN MUESTRAS DE LCR INFILTRADAS POR CMF Nº de células/µl * *p<0,001 % de células 100% *p<0,001 80% 60% 40% 20% 0% * Citología+/CMF+ Citología-/CMF+ Citología+/CMF+ Citología-/CMF+ Punto de corte: <20% y <1 célula B neoplásica/µl Quijano S et al. J. Clin. Oncol. 2009; 27(9):
45 Seguimiento: 105/123 (85%) 20 meses (rango meses) ANALISIS DE RECAIDAS DURANTE EL SEGUIMIENTO Sancho JM, Orfao A; Quijano S. European J. Hematology 2010; 85 (4):
46 GRACIAS
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