Ciclo celular y crecimiento de poblaciones microbianas
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- Marcos Domínguez Sandoval
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1 Ciclo celular y crecimiento de poblaciones microbianas Crecimiento a nivel individual. Crecimiento de poblaciones: medida de masa y nº de células. Crecimiento balanceado. Cinética de crecimiento. Curva de crecimiento en sistema cerrado (batch, discontínuo) Introducción al crecimiento microbiano Puntos de vista del estudio: Individual: Ciclo celular Replicación DNA y segregación de cromosomas Síntesis de nuevos materiales Coordinación de la replicación y la división celular Poblacional Cinética del crecimiento Parámetros cinéticos: tiempo de generación (g), tasa de crecimiento Factores ambientales que afectan al crecimiento Físicos Químicos Crecimiento bacteriano Aumento en el # de células más que en su tamaño Mecanismo fisión binaria Duplicación de DNA Duplicación de macromoléculas, monómeros, iones Síntesis de membranas y pared celular División celular Tiempo de generación variable (prom. 1 3 hr) Depende de factores genéticos, nutricionales y ambientales 1
2 Fisión binaria Fase C n = 1 Fase D n=? Medida del número de individuos (I) Métodos directos: Cámara de Neubauer o Petroff Hauser (para levaduras y células mayores que las bacterianas) Contadores electrónicos de partículas (contador Coulter) Métodos indirectos: Métodos turbidimétricos (ópticos): Espectrofotómetro (mide luz transmitida) 2
3 Cuenta en Cámara Método turbidimétrico El espectrofotómetro mide la turbidez como la cantidad de luz que desvía un cultivo, en unidades de absorbancia (DO) La célula bacteriana dispersa la luz, de manera que no es detectada por el detector sensible a la luz. La curva estandar relaciona la DO con el #células/ml. Una vez que se obtiene, esta curva puede usarse para convertir cualquier medida de DO en #células/ml. Por ejemplo, a partir de esta curva, una lectura de 1,6 unidades de DO significa que el cultivo contiene 1x10 8 células /ml. Contadores electrónicos de partículas (contador Coulter) 3
4 Medida del número de individuos (II) Métodos directos: Recuento de UFC = viables por siembra de muestras de diluciones en placas de Petri Recuento de UFC a partir de grandes volúmenes de suspensiones diluidas: se hacen pasar por filtros de nitrocelulosa o equivalentes (ej.: sistema Millipore ), y se incuban sobre medio sólido Medio líquido en sobrefusión Dispersión sobre superficie Filtración por membrana de Millipore de una muestra (en muestras muy diluidas) 4
5 Medida del crecimiento por masa celular (I) Métodos directos: Determinación del peso húmedo Determinación del peso seco Determinación del N total Determinación de algún componente característico: ADN, ARN Proteínas ATP Clorofilas (en fotosintéticos) Medida del crecimiento por biomasa (II) Métodos indirectos: Consumo de nutrientes QO 2 (consumo de oxígeno) QCO 2 (consumo de dióxido de carbono) Productos del metabolismo Producción de ácidos orgánicos Producción de CO 2 5
6 Cuando se inoculan células a un medio de cultivo? Crecimiento balanceado (=equilibrado) El número de células, cantidad de biomasa, concentración de proteínas, ácidos nucléicos, etc. evolucionan en paralelo (cambian en la misma forma) El incremento por unidad de tiempo de los constituyentes de la población es un valor constante: y el nº de células, la masa u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo Let s take look at animation 6
7 Cinética de crecimiento en cultivo discontínuo (batch) Importancia? Considerando que el cultivo tiene un crecimiento equilibrado en la ecuación 1. N puede representar cualquiera de estos factores. Ecuación 1 N= N o x 2 n N o = número inicial de células N= número de células después de n generaciones n= número de generaciones Como n= número de generación y td es el tiempo que transcurre, en cualquier tiempo de cultivo (T) se puede calcular Ecuación 2 n= T_ td N o N 2 n Ec. 1. N= N o x 2 n N o = # de células al inicio N = # de células después de n generaciones n = # de generaciones o duplicaciones Ec. 2 n= T Tiempo de crec. Exp. td tiempo de duplicación combinando las ec. 1 y 2: Ec. 3 N = N 0 2 T/td 1. Conociendo n y T se puede calcular td = tiempo de generación (g) para diferentes poblaciones bacterianas creciendo exponencialmente en diferentes condiciones de crecimiento. 2. Los Tiempos de generación son buenos indicadores del estado de salud fisiológico de una población bacteriana. 3. Se utilizan frecuentemente para evaluar el efecto + o de algún tratamiento sobre el cultivo bacteriano 7
8 Si se inoculan N bacterias que se duplican cada 3 horas en un medio de cultivo fresco... después de 3 h tendremos 2N bacterias, en otras 3 horas 4N.. Modelo de crecimiento en escalera Se considera que hay crecimiento sincrónico que se ajusta a un modelo geométrico de crecimiento es decir que el aumento de la población se dá en puntos discretos (3, 6, 9, 12, etc. horas). Pero en la práctica aún en las condiciones óptimas de crecimiento esto no se obtiene, porque? Porque las bacterias generalmente pueden encontrarse en diferentes etapas del proceso de división celular por lo que el cultivo no está sincronizado. Incluso si se iniciara con 1 sola célula, la sincronicidad se mantendrá solamente por algunas generaciones. Así, se observa que la gráfica de crecimiento es de tipo exponencial, que permite utilizar modelos con funciones exponenciales para cálcular parámetros de crecimiento y predecirlo a diferentes tiempos. N = N 0 2 T/td Las ecuaciones exponenciales son difíciles de manejar gráficamente, se transforman en una recta, aplicando logaritmos en los dos términos y resulta: Ecuación 4 ln N = ln N 0 + (T/td) ln 2 Donde (T/td)=µ = constante o tasa de crecimiento 8
9 Ejercicios: Entregar el 25 de noviembre antes de las 18:00 horas 1. Si se inoculan 1.2 x10 3 bacterias en un medio de cultivo y después de 4 horas de incubación creciendo exponencialmente se obtienen 1.8 X10 5 bacterias. n=? g =? td=? 2. Cuántas bacterias habrá en un cultivo después de 18 horas si este se inocula con 1x10 2 bacteria que tiene un td= 3 horas 3. Con cuántas bacterias deberá inocularse un medio de cultivo si queremos tener 81,920 bacterias después de 12 horas? 4. Cuánto tiempo tardará una población inicial de 6x10 2 para llegar a 1.3 x 10 4 bacterias? Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número de células (dn) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que describe la cinética es la siguiente: Ecuación 5 Una recta con m=k=µ A la (μ), y se le conoce como constante de crecimiento (tasa de crecimiento). Se puede calcular, despejando Ln N Ln N0 t = μ También se transforma en la siguiente función exponencial: Ecuación 6 y 7 N = N 0 e μt = X = X 0 e μt Es la ecuación general del crecimiento exponencial. 9
10 Para calcular el Td, consideramos que N=2N 0 2N0 = N 0 e μtd Ln2+LnN0 = LnN 0 +μtd Ln2+LnN0 - LnN 0 = μtd Ln2+LnN0 - LnN 0 = μtd Ln 2 = td μ Ejercicio: Si a un t 0 = 2h se cuantifican N = 9.6x10 2 células/ml Y a t = 8h: N = 4.7x10 6 Calcular el valor de µ y Td µ =1.42 h -1 Td = 0.48 horas Crecimiento en sistemas cerrados líquidos El más habitual en laboratorio Cultivo en frascos, tubos, etc. No hay aporte nuevo de nutrientes ni es posible eliminar los productos de desecho del cultivo Se desarrolla a través de una curva característica de crecimiento 10
11 Cultivo continuo (sistema abierto) Cultivo balanceado que se mantiene por tiempo indefinido, por un flujo de nutrientes contínuo; que incluye: Una cámara de cultivo de volumen constante A la que llega un suministro de nutrientes desde una cámara reservorio Desde la cámara de cultivo se elimina parte del cultivo y de sustancias tóxicas por un dispositivo de rebosadero Medio fresco desde reservorio Válvula para controlar el flujo f (en ml/h) Pérdida neta células: -dx/dt = x D Crecimiento bruto: dx/dt = x μ Crecimiento neto: dx/dt = x μ - x D = = x (μ-d) v x D = f/v (en h -1 ) En equilibrio μ = D; luego dx/dt = 0 y x se hace constante f (en ml/h) 11
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