U N I V E R S I D A D D E L A L A G U N A FACULTAD DE BIOLOGÍA

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1 U N I V E R S I D A D D E L A L A G U N A FACULTAD DE BIOLOGÍA ASIGNATURA DE GENÉTICA EVOLUTIVA CURSO 2013/14 PROTOONCOGENES, ONCOGENES Y GENES SUPRESORES DE TUMOR (Un enfoque evolutivo) Marc Baker Samuel Díaz León Grupo /11/2013 1

2 ÍNDICE 1. PORTADA...Pag 1 2. ÍNDICE.Pag 2 3. CÁNCER.. Pag 3 4. GENES QUE AL ACUMULAR MUTACIONES SE HACEN SUSCEPTIBLES A DESARROLLAR CANCER....Pag Protooncogenes-oncogenes Pag Genes supresores de tumor.. Pag 5 5. PODEMOS HABLAR DE EVOLUCIÓN CON RESPECTO AL CÁNCER?......Pag 6 6. ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD EVOLUTIVA EN PROTOONCOGENES Y GENES SUPRESORES DE TUMOR...Pag Búsqueda de información y planteamiento de 1ª Hipótesis..Pag Estudio, metodología y procedimiento Pag Resultados y discusión.pag

3 3. CÁNCER La palabra cáncer es un término muy amplio que abarca más de 200 tipos de enfermedades. Cada uno de estos tipos de enfermedades puede tener características completamente diferentes al resto de cánceres, pudiendo considerarse enfermedades independientes, con sus causas, su evolución y su tratamiento específicos. Sin embargo, todas ellas tienen un denominador común: las células cancerosas adquieren la capacidad de multiplicarse y diseminarse por todo el organismo sin control. Asimismo, la principal causa de que células normales se conviertan en cancerosas, tienen principalmente una explicación genética. Mutaciones en genes concretos que regulan el crecimiento y desarrollo normal de las células dentro de un tejido determinado (principalmente en células somáticas) son las que desencadenan esta alteración celular. Estas mutaciones se producen como consecuencia de determinados productos químicos o carcinógenos y la radiación que dañan el ADN. También algunos virus pueden actuar como causantes de determinados cánceres. Generalmente, los cánceres en sí no se heredan, al tratarse principalmente de alteraciones que se producen en células somáticas. Sin embargo, podemos señalar, dentro de los organismos diploides, el término de sensibilidad familiar. Éste término viene a decirnos, que existen casos en los que uno de los individuos parentales diploides, presenta una mutación en uno de los alelos de algún gen que controla, por ejemplo, la proliferación correcta de la célula. Aun así, la célula no se ve afectada por dicha mutación pues presenta otro alelo que permite a la célula actuar correctamente (mutación provoca la aparición de un alelo recesivo). En esta condición, el individuo parental con dicha mutación, presenta una haploinsuficiencia funcional para dicho gen. Ésta haploinsuficiencia funcional sí puede heredarse y de esta manera, los descendientes presentarán únicamente un alelo normal, mientras que el otro estará mutado. Con un alelo normal presentará más probabilidad de que sufra una mutación en el mismo y, consecuentemente, tener los dos alelos mutados. Ahora la célula de este indviduo ya no actúa correctamente y comienza a proliferarse descontroladamente, desarrollándose un cáncer (son los genes supresores de tumor lo que suelen estar involucrados en estas haploinsuficiencias). 4. GENES QUE AL ACUMULAR MUTACIONES SE HACEN SUSCEPTIBLES A DESARROLLAR CANCER 4.1. Protooncogenes-oncogenes Los protoooncogenes son genes incluidos en el genoma humano que regulan el crecimiento y la diferenciación celular. Sus proteínas se expresan en diferentes momentos del ciclo y son imprescindibles para su regulación. En principio, el término protooncogén puede ser confuso, ya que implica de forma errónea que estos genes existen con el único fin de expresar un fenotipo tumoral, cuando realmente su función es esencial para la regulación del ciclo celular. Determinados cambios estructurales y/o funcionales en los protooncogenes contribuyen a la malignización de la estirpe celular, convirtiéndolos en oncogenes. Estos oncogenes originarán proteínas con expresión/función alterada que favorecerán el crecimiento y/o la invasividad tumoral. 3

4 La investigación de estos genes, ha ido asociada a los avances que se han realizado en biología molecular sobre los genes transformantes de los virus. De esta manera se descubrió la relación entre el virus del papiloma humano y cáncer de cérvix, VHB y cáncer hepático, o VEB y linfoma de Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo, entre otros. Los oncogenes sólo precisan estar mutados en un alelo, para que se produzca la sobreexpresión de una proteína dada y esta ejerza su acción promotora. El paso/activación de protooncogén a oncogén se puede producir por diferentes mecanismos: - Translocación: cuando una parte de un cromosoma se liga a otro. El resultado es un híbrido de cromosoma, detectable en el cariotipo. Esto da lugar a una alteración en la transcripción del DNA. - Mutaciones puntuales: sustitución de un par de bases por otro par en una secuencia de DNA, por ejemplo G:C por A:T. - Amplificación: las células eucariotas están formadas por un genoma diploide, es decir, tienen dos copias de cada gen. En determinadas circunstancias una de las copias puede multiplicarse miles de veces, aumentando su tasa de expresión, dando lugar a la amplificación del gen. Es uno de los mecanismos más habitualmente implicados en la carcinogénesis. - Mutagénesis por inserción: producida por la inserción del ADN del virus en el genoma del huésped. Entre los virus que pueden provocar mutaciones que lleven al cáncer, podemos distinguir entre los pertenecientes al grupo de los retrovirus y los pertenecientes al grupo de los ADN-virus. En una infección retroviral, el virus se integra en el cromosoma de la célula infectada, previa conversión de su ARN en cadena doble de DNA en el citoplasma. Este provirus puede insertase en el genoma cerca de un protooncogén. Cuando ahora el virus se reproduce, el protooncogén (o parte de él) puede incorporarse en el genoma viral. Tras ciclos repetidos de infección viral y reproducción, el protooncogén que porta puede mutar y/o reordenarse en el genoma, de tal manera que se convierte en oncogén. Algunos ejemplos de estos virus son los virus de la leucemia humana 1 y 2 (HTLV-1 y HTLV-2). En cuanto a los ADN-virus, Se integran en el genoma del huésped de forma permanente. Pueden expresar de esta manera genes como E1A y E1B que inactivan p53 y prb y también estimular la ciclina A y E. Algunos ejemplos son el Ag E1A de los adenovirus, el Ag T del SV- 40, y la proteína E6 en el HPV. Se han constatado tres tipos de virus con importancia oncogénica clínica: - Los herpesvirus, como el virus de Ebstein-Barr en relación con linfoma Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo, - Los hepadnavirus, como el virus de la hepatitis B en relación con el hepatocarcinoma 4

5 - Los papilomavirus (HPV) en relación con el carcinoma de cervix, anorrectales, esófago y piel Genes supresores de tumor Los genes supresores de tumores controlan el ciclo celular evitando el crecimiento excesivo. Inhiben el crecimiento celular en condiciones normales. Cuando se produce una mutación en estos genes, sus proteínas no se expresan o dan lugar a proteínas no funcionales, favoreciendo la aparición del proceso de carcinogénesis, al no existir un control de la proliferación celular. Para que estos genes supresores adquieran su capacidad oncogénica, necesitan sufrir mutaciones independientes en ambos alelos, de manera que pierdan completamente su capacidad funcional. Como consecuencia, el crecimiento celular queda sin regulación, produciéndose una proliferación descontrolada que puede conducir a la formación de tumores. Es decir, la alteración se manifiesta con carácter recesivo. También puede ser heredada esta alteración en la línea germinal, lo que explicaría el carácter hereditario de determinados tumores, cuya frecuencia es elevada en una misma familia. En este caso, uno de los alelos ya se hereda alterado, por lo que sólo se necesita una mutación en el otro alelo, para que se manifieste la enfermedad (sensibilidad familiar). Los mecanismos por los cuales se puede alterar la expresión de los genes supresores son similares a los descritos para los protooncogenes. Son numerosos los genes onco-supresores estudiados, entre los más conocidos tenemos p53, retinoblastoma (RB), DCC, MCC, APC, NF1, NF2 y WT-1. 5

6 5. PODEMOS HABLAR DE EVOLUCIÓN CON RESPECTO AL CÁNCER? Para hablar de evolución del cáncer, es necesario distinguir entre evolución del cáncer dentro de un organismo (intrageneracional) y evolución entre generaciones (intergeneracional). Dentro de un organismo, como ya sabemos, los tumores se desarrollan a partir de una única célula alterada que comienza a proliferar de manera anormal. La evolución de estas células se produce gracias a mutaciones adicionales, que darán lugar a la selección de aquellas con una mayor capacidad de proliferación, supervivencia, invasión y metástasis. Él fenómeno se conoce como evolución clonal de tumores (Imagen 1). En cuanto a la evolución del cáncer entre generaciones no se puede llevar a cabo, puesto que el cáncer en sí no se hereda, a menos que estos cambios a los que se han hecho alusión se desarrollen en células gaméticas, lo cual suele acabar con un aborto natural del feto si se expresa en el periodo de desarrollo embrionario. Las mutaciones en los protooncogenes y genes supresores de tumor se producen por lo general en células somáticas. Además se ha visto que estos genes son importantes en la regulación del funcionamiento normal de la célula así como de su ciclo celular, por lo que sería sensato pensar que estos genes no deberían de haber sufrido mutaciones, a lo largo de la historia, que les hagan cambiar la función normal de los mismos. Por esta razón podemos considerar que los protooncogenes y genes supresores de tumor son genes conservados. 6. ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD EVOLUTIVA EN PROTOONCOGENES Y GENES SUPRESORES DE TUMOR 6.1. Búsqueda de información y planteamiento de 1ª Hipótesis Con información bibliográfica escasa sobre la evolución de los protooncogenes y genes supresores de tumor, y consultando con profesores de genética relacionados con la línea de investigación oncogénica o con conocimiento sobre la misma (Dra. Mª Teresa y Mariano Hdez), tenemos consciencia de que un trabajo sobre estos genes desde el punto de vista de su evolución, puede resultar demasiado corto debido a los escasos sucesos de variación (refiriéndonos a la tasa de mutación que éstos presentan sin tener en cuenta la inserción por virus), los cuales se han producido a lo largo de su presencia en los organismos, desde los primeros metazoos (denominados frecuentemente metazoos basales), hasta los metazoos más evolucionados. La principal hipótesis que planteamos es que estos genes son genes muy conservados debido a que se encargan de regular procesos biológicos imprescindibles y que deben ser finamente controlados, pues la principal función de los protooncogenes suele radicar en el control del ciclo celular, mientras que los genes supresores de tumor, principalmente evitan que se produzca un arrastre de daños genéticos a lo largo de una misma línea celular por errores sucedidos en alguna de las fases del ciclo celular (posibles errores genéticos en protooncogenes), dirigiendo a la célula hasta la apoptosis cuando esta serie de errores son irreparables o comprometen la integridad de la línea celular. 6

7 6.2. Estudio, metodología y procedimiento Para poder probar la hipótesis propuesta sobre el alto grado de conservación de estos genes, llevamos a cabo un pequeño análisis comparativo entre una serie de Protooncogenes y Genes supresores de tumor (de manera independiente), con una muestra de 100 genes relacionados con actividades metabólicas. La elección de genes metabólicos para este análisis, se debe principalmente, a que se trata de genes que frecuentemente se ven sometidos a una constante presión selectiva del medio debido a las diversas adaptaciones que los organismos han tenido que llevar a cabo para irse adaptando con respecto a sus condiciones ecológicas ancestrales y/o actuales, por lo que creemos que presentarán un menor grado de conservación. Se han utilizado dos poblaciones, las cuales son estudiadas de forma independiente para la comprobación de variabilidad de estos genes. La población Yoruba (oeste occidental de África) y la población Europea son estudiadas de manera independiente para posteriormente observar si existen diferencias significativas en el grado de conservación de los genes objeto de estudio entre ambas poblaciones. El parámetro de variabilidad genética utilizado para medir la variabilidad en estos genes es la heterocigosidad predichas/estimadas para los SNP s presentes en cada uno de los genes incluidos en el análisis (tanto los genes de estudio como la muestra de 100 genes con los que realizamos el análisis comparativo). Procedimiento: 1. La base de datos utilizada para descargar los datos correspondientes a los SNP s para la muestra de los 100 genes metabólicos utilizados en el análisis comparativo (genes del metabolismo de hidratos de carbono, lípidos y proteínas), así como los correspondientes a los genes de estudio (protooncogenes y genes supresores de tumor), es la conocida como HapMap (Figura 1.1), una herramienta bastante útil para trabajar con genotipos humanos y de las que mayor nº de haplotipos presenta en su registro. Figura 1.1. Logo de la base de datos HapMap (International Hapmap Proyect) 7

8 2. Para la elección de los genes de la muestra, hacemos uso de mapas metabólicos (Figura 1.2.), donde se encuentran reflejados los pasos donde interviene el transcrito (enzima) de cada uno de los genes que intervienen en la ruta metabólica. Estos mapas genéticos metabólicos se pueden encontrar en una base de datos Japonesa conocida por sus siglas en inglés como KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes & Genomes, Figura 1.3.), que es de la cual nosotros hemos seleccionado los 100 genes de la muestra con los que haremos el estudio comparativo. En KEGG fijamos el filtro de búsqueda para obtener mapas genéticos metabólicos de humanos (introducimos las siglas hsa ). Figura 1.2. y 1.3. Representación de Mapa genético metabólico y página principal de búsqueda de mapas genéticos metabólicos en humanos (hsa) respectivamente 3. Una vez tenemos las siglas de los genes metabólicos, la introducimos en el buscador del HapMap y clickeamos en buscar. 4. En configuración seleccionamos la población para la cual queremos descargar el paquete de datos para todos los SNP s para el gen introducido y descargamos en save to disk. 5. Realizamos la descarga para las poblaciones de YRU (Yoruba) y CEU (Europea). 6. Los archivos descargados son abiertos con un software libre para manejar datos extraídos de la base de datos HapMap, conocido como Haploview. 7. Para cada archivo descargado del HapMap (gen de la muestra y genes de estudio), fijamos un valor de exclusión de secuencias donde se encuentran los SNP s a partir de 500 pb, excluimos aquellos individuos con más del 90% de genotipo perdido (Figura 1.4.), fijamos un valor de corte H-W (Hardy-Weinberg) igual a 0 05 y un valor mínimo de frecuencia alélica igual a 0 01 (Figura 1.5.). Clickeamos en rescore markers y se seleccionan únicamente aquellos SNP s que cumplen las condiciones fijadas con anterioridad. Exportamos a un formato compatible con su lectura y manipulación en una tabla de Microsoft Excel (éste es guardado en otra carpeta y debe llevarse este proceso para todos los genes del estudio, pues trabajaremos con todos ellos en una tabla de Excel). 8

9 Figura 1.4. Cuadro de apertura y fijación de valores de parámetros determinados en Haploview Figura 1.5. Tabla de datos vista en Haploview para los diferentes SNP s de un gen no concretado y HetPred para todos los SNP s del mismo. 9

10 8. Abrimos cada archivo compatible con la lectura en Excel y únicamente copiamos la columna de HetPred (heterocigosidad predicha), concretamente hasta donde nos indique error (valores filtrados que no cumplían las condiciones de filtro). 9. En una tabla Excel principal, vamos pegando la columna de HetPred para cada gen y hallamos la media de la heterocigosidad predicha para todos los SNP s correspondientes a cada gen de la muestra. 10. Una vez tenemos la media de la heterocigosidad predicha para la muestra de 100 genes, realizamos una asignación en clases en función de la media de heterocigosidad predicha obtenida para cada gen (tendremos un total de 100 valores). 11. Construimos una distribución de frecuencias con un total de 19 clases con un intervalo cada una de 0 025, a excepción de la 1ª clase, pues generalmente la heterocigosidad predicha media de ningún gen se situaba dentro de esta clase. 12. Se utiliza un intervalo de para obtener una distribución de frecuencias lo más parecida a una distribución normal. 13. Para los Protooncogenes y Genes supresores de tumor realizamos la media de la heterocigosidad predicha (para todos ellos), y posteriormente realizamos una media de las heterocigosidades medias para todos los protooncogenes y los genes supresores de tumor, de forma independiente, obteniendo así, una media de la heterocigosidad para Protooncogenes y otra para Genes supresores de tumor. De esta manera podemos hallar el p-valor de Protooncogenes y Genes supresores de tumor para las dos poblaciones estudiadas. El p-valor nos indica que porcentaje de genes de la muestra se encuentran por debajo de la media para los genes de estudio. Si el p-valor tiene un valor pequeño, esto nos argumenta y corrobora positivamente la hipótesis de que los genes de estudio con los que tratamos son genes con un alto grado de conservación. En caso de no ser así, y que el p- valor sea alto, no podremos considerar que la hipótesis propuesta sea correcta, aunque tampoco podemos rechazarla (esto último se encuentra explicado en resultados y discusión ). 14. El p-valor es representado en cada una de las 4 gráficas construidas (dos para cada población, una dirigida para representar el p-valor de Protooncogenes y otra para representar el p-valor de Genes supresores de tumor) Resultados y discusión Primera Hipótesis: Alto grado de conservación en Protooncogenes y Genes supresores de tumor Resultados 10

11 -Podemos observar en las gráficas expuestas a continuación que el p-valor, el cual nos daría información sobre el grado de conservación de estos genes, no se encuentra en un rango dentro de los genes con los que se compara que podamos interpretar como conservado. - A su vez, hemos utilizado dos poblaciones, siendo la población Yoruba la que mayor grado de diversidad en estos genes debería soportar debido a que la radiación de los primeros humanos se produjo desde África, y la población Europea desciende de una población inicial procedente el continente Africano. -A nivel comparativo, el grado de conservación de los Protooncogenes entre ambas poblaciones se cumple (aunque el p-valor puede suponer ser más alto de lo que deberíamos esperar según la hipótesis propuesta). - A nivel comparativo, el grado de conservación de los Genes supresores de tumor entre ambas poblaciones, en este caso, no se cumple (además de ser el p-valor más alto de lo que deberíamos esperar según la hipótesis propuesta al igual que en estudio en Protooncogenes). -Al comparar el grado de conservación entre Genes supresores de tumor y Protooncogenes dentro de una misma población, obtenemos que en la población Yoruba, los Genes supresores de tumor presentan mayor grado de variabilidad que en Protooncogenes y en la población Europea ocurre lo contrario (los Protooncogenes presentan mayor grado de variabilidad que en Genes supresores de tumor). Figura 1.6. Representación gráfica de la distribución de las Heterocigosidades predichas para los 100 genes de la muestra y p-valor de la heterocigosidad predicha para Protooncogenes de la población Yoruba 11

12 Figura 1.7. Representación gráfica de la distribución de las Heterocigosidades predichas para los 100 genes de la muestra y p-valor de la heterocigosidad predicha para Genes supresores de tumor de la población Yoruba Figura 1.8. Representación gráfica de la distribución de las Heterocigosidades predichas para los 100 genes de la muestra y p-valor de la heterocigosidad predicha para Protooncogenes de la población Europea 12

13 Figura 1.9. Representación gráfica de la distribución de las Heterocigosidades predichas para los 100 genes de la muestra y p-valor de la heterocigosidad predicha para Genes supresores de tumor de la población Europea Nuestra Hipótesis no se encuentra lo suficientemente apoyada por el estudio realizado y podemos sacar diferentes conclusiones y discutir además el porqué de estos resultados. Es necesario afinar algunos aspectos para asegurarnos de tener un menor margen de error, como por ejemplo conocer bien la naturaleza del grado de conservación (no por suposición como hemos hecho nosotros), de los genes escogidos para la muestra de 100 genes con la que llevamos a cabo la comparación, además de obtener una mayor muestra de genes de estudio (protooncogenes y genes supresores de tumor). Discusión -En primer lugar, los genes escogidos para la muestra comparativa, cuyos transcritos presentan su función en el metabolismo, se corresponden con genes que intervienen en rutas metabólicas de diversa naturaleza, además de estar catalizando pasos diferentes. El grado de conservación en los genes escogidos, puede variar significativamente entre unos y otros debido a la versatilidad y/o presión selectiva que se haya originado a lo largo de la evolución en una ruta metabólica o paso metabólico concreto, lo cual repercute directamente en el grado de variabilidad nucleotídica de estos genes tras enésimas generaciones. Este hecho puede situar más o menos alejado de la media de la distribución el p-valor obtenido para el grado de conservación (o veriabilidad) de Protooncogenes o Genes supresores de tumor. -En segundo lugar, el nº de genes seleccionados para obtener el grado de conservación de Protooncogenes y Genes supresores de tumor, son diferentes y pueden ser considerados insuficientes. Para hallar el grado de conservación de Protooncogenes hemos escogido una muestra de tan solo 7 genes (CDK-2, CDK-4, FOS, KIT, K-RAS, MYC, RAF-1), lo cual 13

14 supone un nº escaso de protooncogenes para llevar a cabo el análisis, aunque no tan escaso como el nº de genes escogidos para hallar el grado de conservación de los Genes supresores de tumor, que únicamente han sido 2 genes (TP-53 y CDH-1), debido a que se tuvieron problemas para descargar en el HapMap otros genes considerados Supresores de tumor. Por lo tanto, la muestra de genes supresores de tumor y de protooncogenes utilizados en el análisis puede darnos errores en el mismo debido a que la variabilidad es estimada a partir de una muestra escasa que nos proporciona poca información. -En tercer lugar, la hipótesis propuesta presupone que la población Yoruba debería presentar un grado de conservación en estos genes menor que en la población Europea, debido a que se trata de una población africana. Sin embargo, los Yoruba son una población situada al noroeste de África, concretamente en Nigeria, la cual es probable que haya experimentado un cierto grado de aislamiento debido a que se trata de un grupo étnico cultural y religioso distintivo de otras poblaciones africanas, por lo que posiblemente su variación pueda no ser lo suficientemente representativa de la población africana, la cual si debe presentar un grado de conservación de estos genes menor al de la población Europea. Además, los periodos en los que se produjeron fenómenos de emigración desde África fueron temporal y geográficamente diferentes, por lo que varias poblaciones de zonas geográficamente distintas y en periodos temporales diferentes direon lugar al legado de las poblaciones Europeas, el cual puede variar también en función de áreas geográficas (aunque la homogeneidad en Europa debería ser mayor debido al amplio grado de globalización entre países). -En cuarto y último lugar, hemos propuesto una segunda hipótesis, la cual no tenemos intención de responder en el trabajo presente, la cual propone que el grado de conservación que hemos obtenido para los genes de estudio podrían no ser correctos debido a que se ha obtenido este parámetro (grado de conservación), en función de las mutaciones puntuales a nivel nucleotídico (SNP s) originada en la diversidad de Protooncogenes y Genes supresores de tumor. El porqué de que supongamos que pudiera originarse un alto grado de error en el parámetro Grado de conservación al basarnos en mutaciones puntuales, es porque podría tratarse de mutaciones silenciosas, lo cual da un alto grado de variabilidad nucleotídica, pero no provoca variación en la función de los transcritos del gen estudiado. Por tanto, utilizar como marcador de la variabilidad genética (o grado de conservación de estos genes), la heterocigosidad en los diferentes SNP s de un gen, podría no ser un buen indicador del parámetro en cuestión, y darnos resultados significativamente erróneos y sesgados con respecto a la realidad. Segunda Hipótesis: Baja fiabilidad en la utilización de la heterocigosidad de SNP s como marcador para determinar el grado de conservación génica -Se propone una segunda hipótesis, la cual propone que los SNP s producidos en la secuencia de los genes analizados (protooncogenes y genes supresores de tumor), pueden suponer mutaciones silenciosas las cualeso bien no han producido o han producido un reducido cambio funcional de los transcritos, siendo entonces interpretados como genes con un grado de conservación bastante conservado a nivel postraduccional (a nivel de su función), pero sin embargo algo más variables a nivel de su secuencia nucleotídica, acercándose en este aspecto al grado de veriabilidad observada en otros genes como son los que utilizamos en el estudio comparativo. 14

15 -Para extraer resultados para esta segunda hipótesis, se debería realizar un estudio de la secuencia de estos genes y conocer cuales son las regiones conservadas de los mismos. De esta manera, posteriormente se podrían realizar estudios comparativos y mediante alineamiento de secuencias mediante la utilización de un Software como MEGA por ejemplo, poder averiguar el grado de conservación que presentan estos genes con respecto al resto y entre poblaciones. 15