CURSO DE EXTENSIÓN TEÓRICO PRÁCTICO HERRAMIENTAS EFICIENTES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS DE INTERÉS AGROINDUSTRIAL

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Aurora Peña Espejo
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1 LIBRO DE MEMORIAS

2 2 CURSO DE EXTENSIÓN TEÓRICO PRÁCTICO HERRAMIENTAS EFICIENTES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS DE INTERÉS AGROINDUSTRIAL Santiago de Cali, 23 al 28 de agosto de 2010

3 3 Libro de memorias Curso de extensión teórico práctico: Herramientas eficientes para la identificación de levaduras de interés agroindustrial Santiago de Cali, Colombia, 2010 ISBN: XXX-XXX-XXXX-XX-X Santiago de Cali, primera edición. Editores: Mauricio Ramírez-Castrillón Luz Adriana Mambuscay-Mena William Andrés López-Arboleda Viviana Motato-Vásquez Esteban Osorio-Cadavid Raúl Alberto Cuervo-Mulet Claudio Camilo González-Clavijo Diseño de carátula: Diagramación e impresión: Editorial Universidad de San Buenaventura Correo electrónico PARA CITAR ESTE VOLUMEN: Ramírez-Castrillón, M., Mambuscay-Mena, L.A., López-Arboleda, W.A., Motato-Vásquez, V., Osorio-Cadavid, E., Cuervo-Mulet, R.A., González-Clavijo, C.C. (ed) Libro de memorias curso de extensión teórico práctico: herramientas eficientes para la identificación de levaduras de interés agroindustrial. Primera edición. Santiago de Cali, Colombia. ISBN: XXX-XXX-XXXX-XX-X

Editores: Mauricio Ramírez-Castrillón Luz Adriana Mambuscay-Mena William Andrés López-Arboleda Viviana Motato-Vásquez Esteban Osorio-Cadavid Raúl Alberto Cuervo-Mulet Claudio Camilo González-Clavijo

4 4 Objetivos: PRÁCTICA No. 1: IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS Protocolo obtenido de Osorio-Cadavid et al. (2009) 1. Promover por parte del estudiante de un conocimiento general sobre la identificación taxonómica de una cepa de levadura. 2. Implementar técnicas moleculares de identificación de levaduras. 3. Asignar a nivel de género o especie, levaduras encontradas en bebidas fermentadas 4. Discutir técnicas tradicionales y moleculares de identificación taxonómica de grupos complejos. Fundamento Las levaduras están directamente asociadas a múltiples procesos, no solamente a la producción del pan y de bebidas alcohólicas, sino que cumplen un papel fundamental en el ciclo de muchos minerales en la naturaleza. También es muy bien conocida la enorme capacidad que tienen las levaduras de producir una gran variabilidad de metabolitos primarios y secundarios. Por lo tanto, el campo de las levaduras y su conocimiento, presenta un enorme potencial de aplicabilidad, no solamente a nivel biotecnológico o industrial, sino también ambiental, en el campo agrícola o biológico en general. En este caso, se realizará un muestreo de una fuente rica en levaduras (por ejemplo, una bebida fermentada) y se realizará la identificación mediante secuenciación de la región D1/D2 del gen ribosomal 26S. Esta práctica de laboratorio tiene como propósito permitir al estudiante una visión general de cómo ampliar sus conocimientos a una aplicación práctica de la biología a nivel industrial. Metodología Materiales y Equipos 1 Microscopio 1 Erlenmeyer 500mL 2 Erlenmeyer 1000mL 1 Marcador sharpie 2 Porta y cubreobjetos 2 Cajas de petri Toallas de papel 1 Baño María 30ºC 3 Pipetas 1mL 1 phmetro 1 Shaker de movimiento horizontal 1 Incubadora 2 probetas 250mL 3 Tubos de ensayo 1 Balanza gramera 10 tubos eppendorf 1 microcentrífuga 3 micropipetas 3 tubos Falconer 1 baño de hielo 1 equipo de electroforesis horizontal 1 nevera (-20ºC) 1 tubo PCR 1 termociclador 1 cámara de flujo laminar 4 tubos de ensayo con tapa rosca 1 caja de palillos 1 cámara digital 1 transiluminador 1 filtro UV 1 Cámara digital

Asignar a nivel de género o especie, levaduras encontradas en bebidas fermentadas 4. Discutir técnicas tradicionales y moleculares de identificación taxonómica de grupos complejos.

5 5 Reactivos Agua destilada EDTA Sorbitol 1M, EDTA 0.1M, ph 5 Beta-glucoronidasa Tris-HCl 50mM SDS 10% Acetato de Potasio (KAc) 5M Isopropanol Etanol 70% TE ph 7.4 TBE 1X Taq Polimerasa dntps Primers (2) MgCl2 Agarosa tipo electroforesis Medios de cultivo 1. Cultivo de levadura sobre agar (medio sólido): YPDA Glucosa 2% Extracto de levadura 1% Peptona 2% Agar 2% Suplementar con dos antibióticos (ampicilina y cloramfenicol) 2. Cultivo sobre medio líquido: YPD Glucosa 2% Extracto de levadura 1% Peptona 2% Procedimiento 1. Muestreo A partir de la bebida fermentada presente (fase 2 o 3), se deben realizar cuatro diluciones seriadas (10-2, 10-3, 10-4 y 10-5 ). Adicionar 100μL de cada dilución a la caja de petri y dispersar mediante asa de triángulo hasta secar. Incubar durante 24 a 48 horas Realizar un recuento de colonias y aislar las 4 colonias más representativas hasta purificarla mediante siembra por estría.

Cultivo de levadura sobre agar (medio sólido): YPDA Glucosa 2% Extracto de levadura 1% Peptona 2% Agar 2% Suplementar con dos antibióticos (ampicilina y cloramfenicol) 2.

6 6 2. Extracción de ADN genómico (duración aproximada: 7 horas desde el paso 2) 1. Poner a crecer el cultivo de levadura durante 16 horas en agitación (120rpm) a 28ºC, en 5mL de YPD. 2. Centrifugar a 8000 rpm durante 5 minutos en un tubo eppendorf de 1.5mL (tres veces) 3. Resuspender las células en 0.5mL de una solución que contiene Betaglucoronidasa (50U) en Sorbitol 1M, EDTA 0.1M, ph Incubar en baño a 37ºC durante 1 hora, agitar periódicamente el tubo. 5. Centrifugar a 8000 rpm por 10min y resuspender el pellet en 0.5mL de Tris-HCl 50mM, EDTA 20mM, ph Añada 0.05mL de SDS 10% e incubar en baño a 65ºC por 30min. 7. Añada inmediatamente 0.2mL de Acetato de Potasio (KAc) 5M, resuspender y dejar en hielo por 30min. 8. Centrifugar a 14000rpm por 5min y traslade el sobrenadante a otro tubo. 9. Centrifugue de nuevo por 5min para eliminar otras impurezas y traslade el sobrenadante a otro tubo. 10. Añadir 1mL de isopropanol e incubar a temperatura ambiente por 5min agitando suavemente. 11. Centrifugar a 14000rpm por 10min y descartar el sobrenadante. 12. Añadir 0.5mL de etanol al 70%, centrifugar a 14000rpm por 5min, descartar el sobrenadante, deje secar el pellet 13. Resuspender en 50uL de TE ph 7.4 e incubar por 5min los tubos en baño maría en ebullición. 14. Verificar la extracción en un gel de agarosa al 1%, TBE1X ( v durante 1 hora) 15. Conservar las muestras a -20ºC. 3. Amplificación: Coctel de PCR (28uL): 50 mm NL1 (5 -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ) 50mM NL4 (5 -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3 ). 0.25mM dntps, 1X NH 4 +, 2.5mM MgCl 2, y 1U de Taq Polimerasa. Cantidad de ADN (dilución 1:100): 7uL Condiciones de programa: Las reacciones de amplificación (PCR) serán realizadas en un termociclador (Multigene- Labnet, USA) bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a

Incubar en baño a 37ºC durante 1 hora, agitar periódicamente el tubo. 5. Centrifugar a 8000 rpm por 10min y resuspender el pellet en 0.5mL de Tris-HCl 50mM, EDTA 20mM, ph 7.4. 6. Añada 0.

7 7 94ºC por 5minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 1min, apareamiento a 55ºC por 30seg, y extensión a 72ºC por 1min, con una extensión final de 10min a 72ºC. (Osorio-Cadavid et al. 2008). Para la amplificación, se tomarán 7uL (aproximadamente 1ng/μL) de ADN Genómico extraído y se resuspenderá en 28µL de mezcla de PCR: 0.5μM NL1, 0.5μM NL4, 10μM dntps, 1X NH 4 +, 1.5mM MgCl 2, y 1U de Taq Polimerasa. La calidad de la amplificación fue evaluada en geles de agarosa al 1.5% y visualizadas con Bromuro de Etidio a 240nm.

Para la amplificación, se tomarán 7uL (aproximadamente 1ng/μL) de ADN Genómico extraído y se resuspenderá en 28µL de mezcla de PCR:

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