Obsevación y recuento de células sanguíneas. Semestre B-2010

Transcripción

1 1 Práctica 2 Obsevación y recuento de células sanguíneas Semestre B-2010 Introducción En la sangre se encuentran los leucocitos o glóbulos blancos que son las células móviles del sistema inmunitario. Todos ellos difieren en cuanto a su función y morfología. Los leucocitos no desempeñan sus funciones cuando se encuentran en sangre, sino cuando abandonan ésta y entran a los tejidos linfoides o a las zonas donde hay inflamación intensa. En este sentido, la sangre es un medio de transporte, que le permite a las células sanguíneas recircular entre los diferentes tejidos del cuerpo. Normalmente en sangre se encuentran cinco tipos de leucocitos: monocitos, linfocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Además de estas células, se encuentran presentes las plaquetas, que son fragmentos citoplasmáticos de los megacariocitos que se asientan en la médula ósea. Los leucocitos se estudian en preparaciones coloreadas por dos razones: a fin de determinar la apariencia normal o anormal de las células y sus porcentajes relativos en el diagnóstico de ciertas enfermedades. El recuento de eritocitos y eucocitos es uno de los métodos de rutina Objetivos: 1. Adiestrarse en la preparación y tinción de frotis sanguíneo 2. Describir la morfología de los diferentes tipos de células sanguíneas observadas en el microscopio óptico 3. Adiestrarse en el manejo y uso del hemocitómetro TÉCNICA DEL FROTIS DE SANGRE Las células de la sangre se estudian comúnmente en el laboratorio mediante preparaciones denominadas frotis sanguíneo o extendido sanguíneo. Para ello se prepara una fina película de células sanguíneas sobre un portaobjeto a fin de obtener una capa delgada de células. Después de colorear las preparaciones se observa su morfología al microscopio óptico. Materiales requeridos para el frotis 3 Portaobjetos limpios. Lanceta estéril etanol (para limpiar las láminas) metanol (para fijar la muestra de sangre) Gasa Lápiz de diamante Colorante Giensa Buffer Sorensen Para colorear 2 láminas con frotis sanguíneo, mezcle en un recipiente de vidrio, 9 ml de Buffer Sorensen ph 7.2 y 1ml de colorante Giensa. Tiempo de coloración 20 minutos. PROCEDIMIENTO 1. Lave muy bien tres portaobjetos. Si es necesario límpielos con etanol/éter utilizando un trozo de gasa.

2 2 2. Ubique el sitio de toma de la muestra en la parte lateral del dedo medio o anular de la mano izquierda donde es menos sensible que en la punta, como lo indica el esquema. 3. Limpie el sitio donde se tomará la muestra de sangre, utilizando una gasa empapada con etanol y luego séquelo con gasa. 4. Con una lanceta con un movimiento firme y rápido realizar una pnución en un pulgar. 5. Limpie la primera gota de sangre con gasa. 6. Con la mano derecha tome un portaobjeto y sosténgalo por los bordes. Con la mano izquierda presione el dedo y deje fluir una gota pequeña de sangre (2mm de diámetro). Coloque una gota de sangre sobre el portaobjeto en el centro de uno de los extremos de la lámina. 7. Coloque un segundo portaobjeto apoyado sobre el otro por delante de la gota de sangre en ángulo de 45º, y se hace retroceder hasta que el borde coincida con la gota, que se extenderá por capilaridad por todo el borde. Antes de que la sangre se extienda por los extremos del porta, se hace deslizar por el porta hacia delante con movimiento firme y rápido, elevando la mano derecha antes de que el porta que se desliza llegue al final. Mientras mayor sea el ángulo que forman las dos láminas, mayor será el espesor de la capa de células. gota de sangre Figura 1:Esquema de la disposición de los portaobjetos para realizar el extendido sanguíneo 8. Deje secar la muestra durante 5 minutos. Fije con metanol (1 minuto). Deje secar nuevamente (10 minutos). Coloree con colorante Giensa (20 minutos). Estudio del frotis Examinar la muestra con objetivo de pequeño aumento observando la distribución de la muestra, que debe ser homogénea. Cambiar a objetivo de inmersión (100x), subir el condensador, abrir el diafragma y usar aceite de inmersión. Visualizar los eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Se observan los diferentes leucocitos: Polimorfos nucleares ó granulocitos (PMN) debido a la diferente forma de su núcleo y Mononucleares ó agranulocitos. Eritrocitos: Color rosa pálido. Plaquetas: Color violeta pálido o púrpura. Neutrófilos: Núcleo azul oscuro. Citoplasma rosado con granulaciones rojo violeta. Eosinófilos: Núcleo azul. Citoplasma azul, con gránulos rojo anaranjado.

3 3 Basófilos: Núcleo azul oscuro. Gránulos púrpura casi negros. Linfocitos: Núcleo violeta. Citoplasma azul celeste. Monocitos: Núcleo laxo violeta. Citoplasma azul celeste. Observe el tamaño y la forma de los núcleos (redondeado, lobulado, endentado) en relación con el volumen total de la célula. Observe la apariencia del citoplasma, de los gránulos citoplasmáticos y el color de estos (incoloro, rosado, celeste, azul oscuro). Note la apariencia de la cromatina del núcleo, densamente teñida o pálida. También la posición del núcleo en la célula: (central o excéntrica). Realice dibujos de las células observadas. Para obtener información más completa de la morfología y función de estas células consulte textos de histología disponibles en el laboratorio. Cuales son las funciones de cada una de estas células? TÉCNICA DEL RECUENTO DE ERITROCITOS Y LEUCOCITOS EN CÁMARAS CUENTAGLÓBULOS (HEMOCITÓMETRO) El número total de eritrocitos o leucocitos en sangre se determina mediante el recuento celular en un volumen de sangre conocido. Cualquier método de recuento celular incluye la dilución de la sangre total capilar o venosa (tratada con EDTA) con una pipeta graduada (pipeta de dilución) y el recuento mediante el hemocitómetro y un microscopio óptico convencional. Los recuentos de células se expresan como concentraciones; número de células por unidad de volumen de sangre (céulas/l) Materiales para el recuento celular Líquido de dilución Solución de Hayem (solución isotónica) para el recuento de glóbulos rojos. - Sulfato de Sodio 12,5 g - Acido acético glacial 33,5 ml - Agua destilada 200 ml Solución de Turk para recuento de glóbulos blancos (lisa los eritrocitos). - Acido acético glacial 3 ml - Agua destilada 100 ml Se colorea ligeramente la solución de Turk con azul brillante de Cresil. Pipetas de dilución: 1 Pipeta de Thomas (101) de mezcla para eritrocitos 1 Pipeta de Thomas (11) de mezcla para leucocitos Las pipetas de dilución son pipetas de cristal que consta de un tubo capilar graduado marcado con 0,5 en la quinta señal y con 1 en la décima señal, seguido en su extremo proximal de una dilatación o bulbo que lleva una perlita en su interior para facilitar la mezcla. Por encima del bulbo lleva un capilar corto por donde se introduce el tubo aspirador y con una señal 101 en la pipeta de eritrocitos y una señal 11 grabado en la pipeta de dilución de los leucocitos. La pipeta de recuento de los eritrocitos es roja y la de leucocitos es blanca. La pipeta de dilución de eritrocitos tiene una capacidad de 100 veces el volumen del capilar y la de los leucocitos 10 veces el volumen del capilar. En la pipeta de eritrocitos cuando la sangre es aspirada, hasta la señal de 0'5 y el líquido de dilución es aspiración hasta la señal

4 4 101, la dilución resultante es de 1/200. En caso de las pipetas de dilución de leucocitos cuando el enrase de la muestra de sangre se hace en la marca 11, se realiza una dilución 1/10.Una vez que se llena la ampolla el capilar no contiene células ya que han sido arrastradas por el líquido de dilución. Para observarlo en la cámara de recuento habrá que vaciar su contenido antes. Cámara hemocitómetro 1 Cámara hemocitómetro (Camara de Neubauer) El hemocitómetro o cámara de contaje celular adaptada al microscopio de campo claro se trata de un grueso portaobjetos de cristal en cuyo tercio medio están fijadas 3 plataformas paralelas que se extiende a lo ancho de su superficie. La plataforma central está subdividida por una ranura transversal en 2 mitades cada una más ancha que las 2 laterales y separadas de ellas y entre sí por fosos. Las plataformas centrales o piezas de fondo están exactamente 0'1mm más bajas que las plataformas laterales y tienen una regla de Neubaver mejorada de 3X3 ml y está subdividida en 9 cuadrados secundarios de 1X1 mm (1mm 2 ). Los 4 cuadrados de las esquinas denominados 1, 3, 7 y 9 se utilizan para el y estos están a su vez subdivididos en 16 partes llamados terciarios. El cuadrado central, se utiliza para contar los eritrocitos, y está dividido en 25 cuadrados terciarios, cada uno de los cuales mide 0'2 X 0'2 mm (0'04mm2) y cada uno de estos se dividen en 16 cuadrados más pequeños. Figura 2: Fotografía del hemocitómetro de Neubauer Microscopio óptico PROCEDIMIENTO Muestra de sangre Tome una muestra de sangre del dedo medio o anular como se describe en el procedimiento del frotis de sangre. Presione el dedo para obtener una gota de sangre grande (muestra de leucocitos). Llenado de la pipeta Aspire la gota de sangre en una pipeta Thomas (11), de mezcla para leucocitos calibrada hasta la marca 0,5 y seguidamente aspirar sin formación de burbujas el reactivo de Turk hasta la marca 11. Agite la pipeta vigorosamente durante 1-2 minutos. En la pipeta de mezcla se produce una dilución 1:20. Presione nuevamente el dedo para dejar fluir una gota de sangre grande (muestra de eritrocitos). Aspire la gota de sangre utilizando la pipeta Thomas (101) hasta la marca 0,5 y seguidamente aspire sin formar burbujas, el reactivo de Hayem (para recuento de glóbulos rojos) hasta la marca superior 101. Agite durante 1 o 2 minutos. En la pipeta de mezcla se produce una dilución 1:200. Llenado de la cámara de Neubauer 1. Coloque el cubreobjeto sobre la cámara de Neubauer.

5 5 2. Deseche las tres primeras gotas de la sangre diluida en la pipeta. 3. Coloque la muestra de leucocitos en uno de los compartimientos de la cámara y la muestra de eritrocitos en el otro compartimiento, cuidando de no rebosar el compartimiento calibrado. Si son visibles burbujas de aire o ha entrado líquido en las ranuras a través de los bordes, entonces debe limpiarse a cámara y llenarse de nuevo. 4. Deje reposar las muestras de 2 a 3 minutos para permitir la sedimentación de los glóbulos. Recuento en el microscopio óptico y cálculo de la concentración de células 1. Coloque la cámara de Neubauer sobre la platina del microscopio. Utilice el objetivo 10X para ubicar el cuadrado central de la cámara. 2. Se hace el recuento utilizando el objetivo 40X. Se cuentan los leucocitos en los cuatro cuadrantes de las esquinas (cuadrantes 1, 3, 7 y 9 de la Figura 3) de 1mm de lado cada uno. El cálculo del número de leucocitos por mm 3 se realiza como sigue: Leucocitos por mm 3 = N x 20 x 10 donde N=número de leucocitos contados 4 20 = Factor de dilución 10 = Factor para convertir a mm 3 4 = Número de áreas contadas. 3. Se hace el recuento de los eritrocitos utilizando el objetivo 40X, en 80 cuadrados mínimos =1/5 mm 2, del cuadrado central de la retícula; es decir, en los cuatro cuadrantes de los ángulos y el cuadrado central, los cuales constituyen los 80 cuadrados pequeños. El cálculo se efectúa como sigue: Eritrocitos por mm 3 = N x 200 x 400 x 10 = N x 10 4 donde: N = número de leucocitos contados 200 = Factor de dilución 400 = Factor para convertir a mm 3 10 = Factor para convertir a mm 3 80 = Número de áreas contadas. 8

6 6 Figura 3: Esquema de la retícula de la cámara hemocitómetro de Neubauer Valores de referencia de adultos: Leucocitos 4-9 x 10 9 /L Linfocitos 30% Monocitos 5-9% Neutrófilos 60% Eosinófilos 4% Basófilos 0-1% En valor absoluto: Linfocitos 1-2 x 10 9 /L Monocitos 0,3 x 10 9 /L Neutrófilos 4 x 10 9 /L Eosinófilos 0,2 x 10 9 /L Basófilos 0,1 x 10 9 /L Resultados de la concentración de células en sangre Realice los cálculos de la concentración de eritrocitos y leucocitos en la muestra de sangre, exprese la concentración en céulas por litro de sangre MC/mc septiembre 2010