La PCR. La Reacción en Cadena de la Polimerasa es la herramienta más utilizada

Transcripción

1 La PCR La Reacción en Cadena de la Polimerasa es la herramienta más utilizada

2 PCR- Ventajas y Usos Amplificación ilimitada de secuencias de interés. Rápida, Sencilla y Eficaz. Técnica altamente sensible y específica. Múltiples usos. Aplicaciones en la medicina forense y legal. Detección de patógenos. Diagnóstico de patologías genéticas y adquiridas. Taxonomía molecular.

3 Qué es la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)? Amplificación cíclica de una secuencia de ADN La polimerasa sintetiza en una sola dirección Se necesita un extremo libre Las condiciones físico-químicas son dadas por el buffer

4 Cuáles son los componentes principales de una reacción de PCR? Muestra de ADN que contiene la secuencia a amplificar. Enzima ADN polimerasa. Secuencias cebadoras o primers. Desoxinucleótidos trifosfatos (dntps). Mg Cl 2. Buffer de reacción. Regulación precisa de la temperatura.

5 En la PCR, la separación de las hebras se hace mediante temperatura En la célula En la PCR

6 Los 2 cebadores hibridan con el ADN, definiendo la secuencia amplificada Los 2 cebadores determinan que secuencia se amplificará La polimerasa necesita extremos libres La frecuencia de hibridación se calcula como 1 cada 4 n

7 La elongación ocurre siempre en una sola dirección, pero en las dos hebras Las dos hebras sirven de molde Para secuencias de más de 500 nucleótidos, debe darse tiempo para que la síntesis se complete La polimerasa sintetiza siempre en una sola dirección

8 La reacción en cadena es lo que permite amplificar las secuencias 1) Desnaturalización 2) Hibridación de cebadores 3) Elongación por la polimerasa

9 El cambio entre pasos se da por cambios en la temperatura 1) Desnaturalización 3) Elongación 2)Hibridación de cebadores El proceso físico químico que ocurre se determina sólo mediante una variación controlada de la temperatura

10 Los fragmentos amplificados pueden separarse por electroforesis

11 PCR-Repaso Muestra de ADN que contiene la secuencia a amplificar. Enzima ADN polimerasa. Secuencias cebadoras o primers. Desoxinucleótidos trifosfatos (dntps) Mg Cl 2 Buffer de reacción. Regulación precisa de la temperatura.

12 Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante Cuáles son las aplicaciones de esta tecnología?

13 Secuenciación de ADN mediante el método didesoxi Se basa en el empleo de nucleótidos que detienen la síntesis (en PCR) Se realizan 4 reacciones por separado (una p/cada nucleótido) Originalmente se hacían 4 electroforesis

14 Método didesoxi con sondas fluorescentes Sólo se realiza una electroforesis El cromatograma muestra la fluorescencia de la secuencia que pasa frente al detector

15 Los chips de ADN combinan PCR, bibliotecas, hibridación y sondas Los chips detectan diferencias en patrones de expresión de manera veloz Se utilizan dos colorantes diferentes y dos chips distintos. Mediante una computadora se compara la fluorescencia en los diferentes puntos (o genes) Identifican dianas, permiten diagnósticos, descubrimiento de fármacos, etc

16 La terapia génica se basa en la sustitución de un gen defectuoso La terapia génica se basa en reemplazar genes defectuosos por copias funcionales Por lo general, en humanos se han propuesto usos en línea germinal o en líneas somáticas

17 Organismos transgénicos Qué son? Cómo y por qué funcionan? Ejemplos

18 Por qué funcionan los transgénicos? Bases teóricas de la transformación y expresión de proteínas en otros organismos

19 El código genético es degenerado y casi universal Stop trp Inicio (Se usa formilmetionina)

20 Esto se debe a que tienen un origen común

21 Las similitudes son mayores de lo que generalmente se supone Entre humanos y chimpancés, la cantidad de diferencias en el ADN ronda entre 1.2 y el 3%

22 Los transgénicos Organismos que incorporaron nuevos genes y pueden transmitirlos a su progenie Esto es posible gracias a que la maquinaria molecular es esencialmente idéntica

23 Existen numerosas aplicaciones para los organismos transgénicos

24 Microorganismos

25 Los microorganismos empleados en fermentaciones suelen ser transgénicos

26 Muchos productos farmacéuticos vienen de microorganismos transgénicos Si se expresan proteínas eucarióticas en bacterias, se deben extraer los intrones

27 Animales

28 La transformación en eucariotas se hace mediante disparos, inyección o virus En humanos se utilizan adenovirus o inyecciones mediante micromanipuladores.

29 Se pueden obtener productos de alto valor agregado en la leche No siempre es necesario eliminar exones. Los patrones de glicosilación son más parecidos.

30 Uso en Acuicultura Incremento de tasa de crecimiento en trucha o en peces y moluscos confinados mediante inserción de genes que codifican la hormona de crecimiento

31 Plantas

32 Repaso: transformación de células vegetales

33 En Argentina, los transgénicos más usados son los resistentes a herbicidas Los cultivos transgénicos tienen gran importancia económica en nuestro país

34 Algunos productos transgénicos aprobados para su cultivo en Argentina

35 La detección y fiscalización se realiza con herramientas de biología molecular

36 Resumen de un protocolo de detección

37 Resumen de un protocolo de detección Los blancos de detección pueden ser los productos (proteínas) insertados o restos de las quimeras empleadas

38 Algunas consideraciones sobre el uso de transgénicos

39 Cuáles son las razones por las que se cultivan transgénicos?

40 Quién se queda con los beneficios económicos?

41 Mayores empresas involucradas en el negocio de los transgénicos