Poder antioxidante de hongos cultivados en La Rioja

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1 Poder antioxidante de hongos cultivados en La Rioja V. Grifoll, M.L. Tello, I. Roncero-Ramos y M. Pérez Centro Tecnológico de Investigación de Champiñón de La Rioja (CTICH), Ctra. Calahorra, km 4; Autol CP microbiología@ctich.com Resumen Los hongos presentan propiedades beneficiosas para la salud tanto derivadas de su composición nutricional como de las actividades biológicas que se les atribuyen como antioxidante, inmuno-modulatoria y antitumoral, entre otras. Por ello, el objetivo de este trabajo ha sido determinar la composición química de 10 especies cultivadas en La Rioja y su actividad antioxidante. Los resultados obtenidos indican que estos hongos son adecuados para introducirlos en nuestra dieta habitual debido a su menor valor energético y bajo porcentaje de grasas y su alta capacidad antioxidante. Palabras clave: Actividad antioxidante, compuestos fenólicos, setas cultivadas INTRODUCCIÓN La Rioja es la región líder a nivel nacional en la producción de champiñón y, en cuanto al cultivo de otros hongos, nuestra comunidad autónoma tiene una producción del 10% de Pleurotus ostreatus y un 0,5% de Shiitake, aproximadamente. Además, otros cultivos emergentes como el de Agrocybe aegerita y Pleurotus eryngii están cobrando importancia en esta región en los últimos años. Desde el punto de vista nutricional, los hongos poseen características deseables en los alimentos como son el sabor, su bajo aporte calórico y su bajo contenido de sodio (Dubost et al., 2007). Diversos hongos estudiados han mostrado ser excelentes alimentos nutritivos debido a la presencia de un alto contenido de fibra dietética y bajo contenido de grasas (Furlani y Godoy, 2007). Recientemente, se han puesto de manifiesto los beneficios del consumo de hongos en la prevención de enfermedades. Los compuestos bioactivos que poseen dichos alimentos han mostrado tener cierta actividad inmune, antitumoral, cardiovascular, antiviral, antibacteriana, antiparasitaria, hepatoprotectora y antidiabética (Ma et al., 2013; Liu et al., 2013a). Algunos de estos compuestos tienen la capacidad de hacer frente al estrés oxidativo, en definitiva, son antioxidantes naturales (Liu et al., 2013b). Dicha actividad antioxidante hace que los hongos posean un mayor atractivo como alimento funcional y como fuente de sustancias beneficiosas. El objetivo de este trabajo es conocer la composición química de champiñón y setas cultivados en La Rioja en función de sus características físicas, químicas y potencialmente saludables. Los compuestos bioactivos extraídos se estudiarán en relación a su actividad antioxidante. MATERIAL Y MÉTODOS Selección de variedades y preparación de los liofilizados Las especies seleccionadas son aquellas en las que su cultivo había sido estandarizado y optimizado en las plantas piloto del CTICH. Con los hongos recolectados se procede en el laboratorio a su codificación, limpieza, troceado y posterior congelación a -20 C para su conservación hasta su liofilización. 59

2 En cuanto a la codificación, cada hongo se codifica mediante dos letras: Lentinula edodes (LE) Agrocybe aegerita (AA) Hericium erinaceus (HE) Pholiota nameko (PN) Hypsizigus ulmarius (HU) Pleurotus ostreatus (PO) Pleurotus eryngii (PE) Agaricus bisporus (AB) Hypsizigus tessulatus gris (HTg) Hypsizigus tessulatus blanca (HTb) Caracterización de la composición química Se determinan los parámetros de composición centesimal incluyendo humedad, cenizas, grasas y proteína, carbohidratos y energía; se realiza siguiendo los métodos de la A.O.A.C. (1990) excepto en el caso de los carbohidratos totales que se obtienen por diferencia respecto a otros componentes y la energía que se calcula a partir de los equivalentes energéticos de los nutrientes (Morillas-Ruiz y Delgado-Alarcón, 2012): Carbohidratos totales (%): 100 (% humedad % proteínas % grasas % cenizas) Energía Total (Kcal): 4* % proteína * % carbohidratos + 9 * % grasas En el contenido de carbohidratos totales está incluido el contenido de fibras. La energía total es una estimación ya que no se dispone del valor del contenido de fibra. Todos los parámetros, excepto la humedad, se determinan con el hongo liofilizado por lo que los resultados son en base a peso seco. Obtención de extractos Se realizan extracciones con solvente orgánico (metanol) para determinar la capacidad antioxidante de los hongos del estudio. Para la obtención de los extractos metanólicos se pesan 1.5 g de hongo liofilizado y se añade 40 ml CH 3 OH. A continuación se incuba a temperatura ambiente durante 1h en agitación a 150 rpm y se guarda el sobrenadante. El proceso se realiza por duplicado. Los sobrenadantes se centrifugan a rpm, a 20 C durante 10 min. Posteriormente se mide el volumen de extracto metanólico recuperado en la extracción con la ayuda de una probeta y se guarda bien sellado con parafilm a 4 C y en oscuridad, utilizando papel de aluminio. Evaluación de la capacidad antioxidante Ensayo del radical DPPH. 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo El método DPPH permite determinar la capacidad de captura de radicales libres de un compuesto. Este método fue desarrollado por Brand-Williams et al. (1995) se basa en la reducción de la absorbancia medida a 517 nm del radical DPPH por antioxidantes. Ensayo Poder Reductor El principio de este método consiste en que sustancias que tienen un potencial reductor, reaccionan con el ferricianato de potasio (Fe 2+, ión ferroso) para formar ferrocianato de potasio (Fe 3+, ión férrico) el cual reacciona con el cloruro de hierro para formar el complejo Fe4[Fe(CN)6]3 dando lugar a un color azul característico que absorbe a 700 nm. Fenoles totales El ensayo Folin-Ciocalteu, ha sido utilizado durante muchos años, como medida del contenido de compuestos fenólicos totales en productos naturales (Singleton y Rossi, 60

3 1965). Se trata de una reacción redox,el agente oxidante utilizado fue el reactivo de Folin- Ciocalteu. Se obtiene un máximo de absorbancia a 765 nm y es cuantificado con la ayuda de una recta de calibrado utilizando como patrón, ácido gálico. Para comprobar que los métodos desarrollados han sido satisfactorios, utilizamos como control positivo un compuesto puro, el ácido ascórbico, del que se sabe que tiene un alto poder antioxidante. Métodos estadísticos El análisis estadístico fue realizado utilizando un test de ANOVA y post-hoc. Las diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas cuando la p<0.05. El análisis estadístico se ha realizado con el software estadístico SPSS19.0. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Caracterización de la composición química Tabla 1.- Composición centesimal. Hongo Humedad Proteína Grasas Cenizas Carbohidratos Totales* Energía * AB 92,97±0,03 a 18,82±0,03 d 3,82±0,13 abc 10,12±0,02 a 67,24 361,80 AA 90,45±0,13 c 19,16±0,34 d 3,42±0,41 abc 7,36±0,15 c 70,06 373,78 HE 87,14±0,13 f 15,27±0,02 e 3,56±0,43 abc 7,75±0,14 c 73,42 370,15 HU 89,11±0,09 e 36,50±0,10ª 5,08±0,38 ab 10,17±0,09 a 48,10 368,84 HTb 89,69±0,08 d 22,31±0,05 bc 2,80±0,28 bc 8,99±0,19 b 65,90 368,45 HTg 90,33±0,05 c 19,34±0,13 cd 4,18±0,67 abc 7,54±0,24 c 68,94 373,51 LE 90,03±0,09 cd 12,25±0,06 f 2,79±0,24 cb 6,36±0,04 d 78,60 361,60 PE 86,83±0,09 f 17,79±0,00 de 1,86±0,72 cb 5,98±0,04 d 74,82 372,70 PN 91,27±0,14 b 15,56±0,15 e 2,03±0,67 c 6,43±0,12 d 75,98 365,45 PO 91,43±0,10 b 23,01±0,11 b 6,34±0,81 a 10,73±0,06 a 59,92 366,79 Resultados expresados en %(p/p)materia seca, humedad (materia fresca) y energía (kcal/100 g).cada valor se expresa como media ± SEM (n:3) excepto en grasas (n:2) y humedad (n:8). Letras diferentes indican diferencias entre grupos (p<0.05).* Carbohidratos y Energía se determinaron con ecuaciones (Morillas-Ruiz y Delgado- Alarcón, 2012). Una vez analizados los diferentes hongos se observa que el contenido de agua es similar entre ellos con una media del 89.9%. Su principal componente (después del agua) son los carbohidratos (68%). El gran porcentaje de agua que poseen hacen posible un bajo aporte calórico, las especies estudiadas presentan valores similares de energía, con un valor medio de 385 Kcal. Los hongos estudiados contienen entre 19-35% de proteínas expresados sobre sustancia seca, los niveles más altos se han encontrado en las especies HU (36.65%), PU (23.01%) y HTg (22.31%). El mayor contenido de grasa lo presentan PO y HU aunque, en general, la mayoría de los hongos presentan un bajo porcentaje graso entre 2-4%. Estos datos reafirman que los hongos son una buena fuente proteica y, a su vez, aportan un porcentaje bajo en grasas (Diez y Álvarez, 2001). 61

4 Evaluación de la capacidad antioxidante %Inhibición DPPH_Extractos metanólicos ,0 1,0 2,0 mg/ml 3,0 4,0 5,0 AB PO AA HE HU PE LE HTg HTb PN Figura 1. Representación gráfica del % Inhibición mediante ensayo DPPH (media; n: 2) ABS 700nm 1,5 1 0,5 Poder Reductor_Extractos Metanólicos mg/ml Figura 2. Representación gráfica del poder reductor. Cada valor representa media (n:2) Tabla 2. Evaluación de la capacidad antioxidante Hongo Actividad DPPH (IC50; mg/ml) Actividad poder reductor (IC50; mg/ml) AB 0,54±0,01 a 2,71±0,05 a AA 0,51±0,03 a 2,03±0,08 a HE 1,44±0,06 ab 4,32±0,37 b HU 0.43±0,02 a 1,95±0,11 a HTb 15,25±1,31 d 7,35±0,13 d HTg 3,85±0,55 c 7,43±0,55 d LE 3,74±0,28 c 5,80±0,38 c PE 1,14±0,11 a 4,46±0,48 b PN 2,68±0,18 bc 5,10±0,57 bc PO 0,72±0,11 a 2,74±0,32 a AB PO AA HE HU PE LE HTg HTb PN Valores de IC50 (mg/ml) calculados a partir de las rectas de regresión lineal. Letras diferentes indican diferencias entre grupos (p<0.05) Los resultados del ensayo de DPPH (Fig.1) en los extractos metanólicos muestran que los hongos con mayor capacidad antioxidante son AA, HU y AB alcanzando inhibiciones de 87.86% % y 88.36%, respectivamente. Con un poder antioxidante intermedio encontramos a PO con una inhibición de 86.20% a una concentración de 2mg/mL, PE con una inhibición de 83.11% a una concentración 2.5mg/mL y HE con una 62

5 inhibición de 88.7% a una concentración de 5 mg/ml. Por último, entre los de menor poder antioxidante destaca HTb con un 17.99%. A partir de los gráficos de inhibición, para entender el poder antioxidante de los extractos, se calcula el parámetro IC50. Éste método consiste en determinar la capacidad antioxidante mediante el cálculo de la reducción del 50% de inhibición debido a la adición de la muestra. Para ello se representaron los valores y se calculan las rectas de regresión lineal (Tabla 2). De los resultados encontrados en los extractos metanólicos, se puede apreciar que las especies HU, AA, AB, PO y PE presentan IC50 más bajos por lo que pueden ser clasificados como mejores antioxidantes, ya que a más bajas concentraciones producen una inhibición de entre el 80 y el 90%. En la determinación del poder reductor en los extractos metabólicos (Fig.2) encontramos resultados similares al DPPH, dónde el mayor poder reductor de las defensas antioxidantes no enzimáticas pertenece a HU seguido por AB, PO y AA y el de menor poder reductor a HTb. Los resultados del IC50 reflejan estos datos teniendo HU el valor más bajo (IC mg/ml) y, por tanto, mayor actividad antioxidante (Tabla 2). 30,0 Fenoles Totales 20,0 10,0 0,0 HU AB PO AA HE PE LE HTg HTb PN Figura 3. Representación gráfica del contenido de fenoles totales (media±sem). Letras diferentes indican diferencias entre grupos (p<0.05) Los resultados de fenoles totales (Fig.3) están en la misma línea que los dos ensayos anteriores ya que las especies que tienes mayor contenido de fenoles son HU, AB, PO y AA. En general, en la evaluación de la capacidad antioxidante, se observa que los extractos metanólicos que han presentado mayores porcentajes de inhibición en el ensayo de DPPH son los mismos que alcanzan niveles superiores en los otros dos test. Los datos mostrados en este estudio coincide con la bibliografía existente en este campo, la cual destaca la mayor actividad antioxidante que muestra el champiñón (AB) (Liu et al., 2013b). Existen también varios estudios sobre el hongo P. ostreatus (PO) en los que se ha observado que inhibe la peroxidación lipídica y posee gran poder reductor (Jayakumar et al., 2009). En cuanto a Hypsizigus ulmarius (HU), el hongo que ha mostrado mayor actividad antioxidante, son necesarios más estudios que evalúen su capacidad antioxidante ya que son escasos los datos bibliográficos encontrados. Comparando nuestros resultados con los datos de actividad antioxidante de frutos rojos, los cuales se consideran productos de alta capacidad antioxidante, observamos que las especies AA, HU y AB tienen un valor de IC50 similar al de los frutos rojos. En cuanto a la cantidad de compuestos fenólicos, la mayoría de los hongos estudiados alcanzan la misma concentración que la de los frutos rojos (Samappito y Butkhup, 2010). 63

6 CONCLUSIONES El estudio de la composición nutricional de los hongos comestibles, cuyo cultivo se ha hecho con sustratos propios de La Rioja, concluye que éstos son una buena fuente de proteínas, carbohidratos, con un bajo contenido de grasas y energía. Los resultados obtenidos sugieren que hongos como Agaricus bisporus, Hypsizigu sulmarius, Agrocybe aegerita y Pleurotas ostreatus poseen elevada capacidad antioxidante y alta concentración de fenoles. Los hongos son un alimento idóneo para incluirlos en nuestra dieta habitual por las propiedades nutricionales y saludables que presentan. Agradecimientos Los autores agradecen la financiación recibida al Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente con la contribución del Fondo Europeo Agrícola de Garantía (FEAGA) y el Fondo Europeo Agrícola de Desarrollo Rural (FEADER). Referencias A.O.A.C Official Methods of Analysis. In: Association of Official Analytical Chemists. Eds. Horwitz, Washington D.C. Brand-Williams, W., Cuvelier, M.E. yberset, C Use of free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensm. Wiss. Technology, 22, Diez, V.A., Alvarez, A Compositional and nutritional studies on two wild edible mushrooms from Northwest Spain. Food Chemistry, 75, Dubost, N.J., Ou, B. y Beelman, R.B Quantification of polyphenols and ergothioneine in cultivated mushrooms and correlation to total antioxidant capacity. Food Chemistry, 105, Furlani, R.P.Z. y Godoy, H.T Nutritional value of edible mushrooms. Ciencia y Tecnologia de Alimentos, 27(1), Jayakumar, T, Thomas, P.A., Geraldine, P In-vitro antioxidant activities of an ethanolic extract of the oyster mushroom, Pleurotus ostreatus. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 10, Liu, J., Jia, L., Kan, J. y Jin, C.H. 2013a. In vitro and in vivo antioxidant activity of ethanolic extract of white button mushroom (Agaricus bisporus). Food and Chemical Toxicology, 51, Liu, K., Wang, J., Zhao, L. y Wang, Q. 2013b. Anticancer. antioxidant and antibiotic activities of mushroom Ramaria flava. Food and Chemical Toxicology, Ma, L., Chen, H., Dong, P. y Lu, X Anti-inflammatory and anticancer activities of extracts and compounds from the mushroom Inonotus obliquus. Food Chemistry, 139, Morillas-Ruiz, J.M. y Delgado-Alarcón, J.M Análisis nutricional de alimentos vegetales con diferentes orígenes: Evaluación de capacidad antioxidante y compuestos fenólicos totales. Nutrición Clínica y Dietética Hospitalaria, 32(2), Samappito, S. y Butkhup, L Analysis of anthocyanin, flavonoids, and phenolic acid contents of ten fruits and antioxidant activity. International Journal of Fruit Science, 10(3), Singleton, V.L. y Rossi, J.A Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture, 16,