BIO-FLASH. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n Lliçà d Amunt - Barcelona - SPAIN

Transcripción

1 LEER CAMBIOS SOMBREADOS BIO-FLASH anti-hiv tests BIO-FLASH anti-hiv 1+2 es un inmunoensayo quimioluminiscente de dos pasos totalmente automatizado para la determinación cualitativa de anticuerpos frente a HIV-1 y HIV-2 en suero o plasma humano con el instrumento BIO-FLASH. Sumario En 1983 se estableció el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) como agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). 1,2 El SIDA es una enfermedad causada por dos retrovirus relacionados, denominados HIV-1 y HIV-2. Estos virus atacan al sistema inmunitario reduciendo su protección y permitiendo la aparición de infecciones oportunistas, a menudo infecciones graves y mortales, y tumores. El número de personas que viven con el HIV se está incrementando en todo el mundo y en 2008 se estimó en unos 33 millones. 3 Sin embargo, el número de muertes debidas a enfermedades relacionadas con el SIDA está disminuyendo paulatinamente gracias a los tratamientos antirretrovirales. El HIV se transmite por contacto directo de una mucosa o la sangre con un líquido corporal que contiene HIV. El patrón de transmisión varía en las diferentes partes del mundo. En Europa occidental, Norteamérica y Australia la transmisión se produce mayormente en poblaciones de alto riesgo como hombres que tienen relaciones sexuales con los de su mismo sexo y consumidores de drogas inyectadas, mientras que en el África subsahariana predomina la transmisión heterosexual y maternofilial. Globalmente el HIV-1 es la causa de la mayoría de las infecciones HIV. El HIV-2, descubierto en , es menos virulento e infeccioso que el HIV-1 y se limita principalmente a África occidental. La estructura del HIV-1 consiste en un núcleo que contiene ARN, proteínas de la nucleocápside y las enzimas necesarias para el desarrollo del virión, envuelto por una cápside compuesta de la proteína viral p24. El núcleo está rodeado por una matriz compuesta de la proteína viral p17. Toda esta estructura está rodeada por una envoltura formada por una bicapa lipídica que contiene proteínas de la célula huésped y una glucoproteína compleja. Este complejo está formado por tres moléculas externas denominadas glucoproteínas gp120 y una glucoproteína compleja transmembrana formada por tres moléculas gp41. El HIV-1 y el HIV-2 comparten múltiples epítopos comunes en sus antígenos nucleares, aunque las glucoproteínas de la envoltura muestran una menor reactividad cruzada. El inmunoensayo BIO-FLASH anti-hiv 1+2 utiliza antígenos recombinantes con secuencias pertenecientes tanto al HIV-1 como al HIV-2. Los dos virus se diferencian entre sí en el uso de dos proteínas recombinantes de la envoltura específicas, a saber, gp41 y gp36. La determinación de los anticuerpos frente al HIV se usa para examinar la sangre o los hemoderivados con el fin de prevenir la transmisión del HIV y diagno sticar una supuesta infección por HIV. La detección de la infección por HIV es importante por razones de seguridad, prevención y pronóstico individual de la infección. Principio Cuando las micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH anti-hiv 1+2 se mezclan e incuban con la muestra, si ésta presenta anticuerpos específicos anti-hiv, éstos se combinan con los antígenos de HIV que recubren las micropartículas. Después de una separación magnética y lavado para eliminar la muestra residual, se añade un trazador que consiste en antígenos de HIV marcados con isoluminol que puede unirse a los anticuerpos anti-hiv capturados por las micropartículas. Tras una segunda incubación, separación magnética y otro lavado, se añaden los reactivos que activan la reacción quimioluminiscente. El luminómetro del BIO-FLASH mide la luz emitida como unidades relativas de luz (URL), que son directamente proporcionales a la concentración de anticuerpos anti-hiv en la muestra. El BIO-FLASH utiliza un método de reducción de datos con ajuste a una curva logística de 4 parámetros (4PLC) para generar una Curva de Calibración Maestra (CCM). Esta curva viene predefinida, depende del lote y se almacena en el instrumento a través del código de barras del cartucho. Con la medición de los calibradores (que se suministran en un kit aparte), la CCM predefinida se transforma en una Curva de Calibración de Trabajo (CCT) nueva y específica para el instrumento. Las concentraciones de los calibradores están incluidas en los códigos de barras de los tubos de calibradores.

2 Esquema de la reacción: Activadores (Triggers) URL Partícula magnética Muestra Trazador Emisión de luz Componentes Cartucho de reactivos El kit BIO-FLASH anti-hiv 1+2 contiene un cartucho de reactivos para 100 determinaciones (REF ). NOTA: El diseño del cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Diseño CE ) Composición del cartucho de reactivos: El cartucho se compone de 3 viales que contienen: A. 1 vial cilíndrico de suspensión de micropartículas recubiertas con antígenos de HIV recombinantes purificados (HIV-1 core p24, HIV-1 envoltura gp41 y HIV-2 envoltura gp36). Contiene < 0,1% de azida sódica. B. Posición sin vial. C. 1 vial opaco de trazador consistente en antígenos de HIV recombinantes purificados (HIV-1 core p24, HIV-1 envoltura gp41 y HIV-2 envoltura gp36) marcados con isoluminol. Contiene < 1,0% de Triton-X 100 y < 0,1% de azida sódica. D. 1 vial vacío. Preparación Véase la figura siguiente. Cartucho: las micropartículas sedimentan durante su transporte y almacenamiento, por lo que se tienen que mezclar para volverlas a resuspender. La primera vez que vaya a utilizar el cartucho, inviértalo suavemente 30 veces sin que se forme espuma (las burbujas pueden hacer que los sensores de líquido del instrumento den lecturas erróneas). Compruebe que las micropartículas se hayan resuspendido totalmente. Si no es así, siga invirtiendo el cartucho hasta que se resuspendan en su totalidad. Si las micropartículas no se resuspenden o detecta que el precinto de los reactivos está roto, NO UTILICE EL CARTUCHO. Una vez resuspendidas las micropartículas, sitúe el cartucho sobre una superficie sólida y retire con cuidado la lengüeta roja de seguridad para el transporte. Manteniendo el cartucho en la superficie sólida, apriete las dos pestañas situadas a los lados del tapón perforador (parte gris) y presione la parte superior del cartucho hasta que quede en posición de bloqueo. Una vez en posición de bloqueo, las pestañas tienen que quedar ocultas. No invierta el cartucho abierto. Deje reposar el cartucho durante 5 minutos antes de cargarlo en el instrumento. Una vez cargado el cartucho, el instrumento mezcla su contenido de forma automática a intervalos periódicos.

3 Precauciones Los reactivos BIO-FLASH son para diagnóstico IN VITRO. Uso exclusivo para profesionales. La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante. ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Deseche todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Por favor, no reutilice ni reintroduzca reactivos en los cartuchos o viales. Recolección y conservación de las muestras Usar suero fresco (también se pueden utilizar tubos con gel separador de suero) o plasma (Li-heparina, Na-heparina, Na-citrato, EDTA y ACD). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Los anticoagulantes líquidos como el Na-citrato ejercen un efecto de dilución y pueden reducir la concentración de muestras de pacientes. El uso de plasma con EDTA puede producir concentraciones más elevadas en muestras individuales de pacientes. Las muestras no deben ser inactivadas por calor. Las partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. En las directrices CLSI H18-A3 y H21-A5 encontrará más información sobre la manipulación, el transporte, el procesamiento y la conservación de las muestras. Suero Las muestras de suero pueden ser conservadas entre 2-8 C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20 C. Las muestras pueden congelarse/descongelarse un máximo de 3 veces. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis. Plasma Las muestras de plasma pueden ser conservadas entre 2-8 C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20 C. Descongelar el plasma a 37 C. Descongelar las muestras sólo una vez. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis. Volumen de muestra El volumen de muestra necesario para realizar una única prueba con BIO-FLASH anti-hiv 1+2 varía en función del tipo de recipiente que se utilice. Una prueba requiere al menos 125 µl más el volumen muerto, que es de 200 µl si se utiliza la copa de muestra recomendada (REF ). Otros materiales Los siguientes materiales no se suministran con el cartucho de reactivos y se tienen que comprar aparte. REF REF BIO-FLASH anti-hiv 1+2 Calibrators (Calibradores) BIO-FLASH anti-hiv 1+2 Controls (Controles) Lea detenidamente las instrucciones correspondientes si desea más información.

4 No utilice otros calibradores. La información que necesita el instrumento BIO-FLASH para calibrar el ensayo BIO-FLASH anti-hiv 1+2 está incluida en los códigos de barras de los viales. Utilizar controles de otros fabricantes puede dar lugar a resultados imprevistos. Asegúrese de que en el instrumento BIO-FLASH haya una cantidad suficiente de los siguientes consumibles antes de procesar muestras, calibradores o controles: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas) Nota: El diseño de las cubetas está protegido por patente (US D560,816 / Diseño CE ) REF REF BIO-FLASH Triggers (Activadores) BIO-FLASH System Rinse (Solución del sistema) Instrumento / realización del ensayo En el Manual del Usuario del BIO-FLASH encontrará las instrucciones completas para realizar el ensayo. Calibración El código de barras del cartucho contiene una Curva de Calibración Maestra (CCM) que es válida para el lote de reactivos. Sin embargo, para todos los reactivos se necesita una Curva de Calibración de Trabajo (CCT), que es específica para cada lote y válida hasta la fecha de caducidad de éste. Se debe obtener una nueva CCT cuando los resultados de los controles salgan fuera del rango de aceptación o cuando se hayan realizado ajustes en el instrumento. Lea detenidamente el Manual del Usuario del BIO-FLASH para configurar una CCT. Control de calidad Para realizar un programa completo de control de calidad se recomiendan tres controles. Los Controles BIO-FLASH anti-hiv 1+2 negativo, positivo anti-hiv-1 y positivo anti-hiv-2 se han diseñado para dicho programa. Los controles se deben analizar al menos cada 24 horas por día de utilización. Asegúrese de que los resultados de los controles se encuentran dentro del rango de aceptación ya que, si no es así, puede ser indicativo de resultados no válidos, ante los que el usuario deberá tomar medidas correctivas. En este caso, verifique todos los resultados obtenidos desde la última comprobación de control de calidad aceptable del analito en cuestión. Puede resultar necesario recalibrar el instrumento. En el Manual del Usuario del instrumento encontrará más información. Para la identificación y resolución de situaciones anormales de control de calidad, consulte Westgard et al. 5 Conservación y estabilidad Los reactivos que no se hayan abierto se mantienen estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del cartucho si se conservan entre 2-8 C en posición vertical. Una vez abierto, la estabilidad del cartucho cargado en el instrumento BIO-FLASH o guardado a 2-8 C es de 10 semanas. Interpretación de resultados La cantidad de analito en cada muestra se determina a partir de la luz emitida (URL), mediante interpolación en la Curva de Calibración de Trabajo almacenada. Los resultados de BIO-FLASH anti-hiv 1+2 se expresan como S/CO (Señal de la muestra/valor de corte). Como el ensayo es cualitativo, el valor numérico del resultado sólo es indicativo de la cantidad de anticuerpo presente. La determinación de los anti-hiv con el ensayo BIO-FLASH anti-hiv 1+2 se interpreta de la siguiente manera: Las muestras con un resultado < 0,90 S/CO se consideran no reactivas (negativas). Las muestras con un resultado 0,90 y < 1,00 S/CO se consideran indeterminadas (zona gris). Las muestras con un resultado 1,00 S/CO se consideran reactivas (positivas). Las muestras con resultado inicialmente reactivo o indeterminado deben ser reanalizadas por duplicado. Si en la repetición ambos valores son inferiores a 0,90, el resultado final de la prueba se interpreta como negativo para anti-hiv. Si el resultado es positivo o indeterminado, la muestra debe ser investigada con una prueba adicional para confirmar el resultado. Un resultado repetidamente positivo es indicativo de infección por HIV. Las muestras con una concentración de anti-hiv superior a 100,00 S/CO se expresan como > 100,00. Limitaciones El resultado de una única muestra no es suficiente para diagnosticar una infección por HIV. Por tanto, además de los resultados de BIO-FLASH anti-hiv 1+2 deben tenerse en cuenta otros datos como, por ejemplo, la sintomatología, la historia clínica, los resultados de otras pruebas y demás información relevante. Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposición a o infección por HIV. Como en todos los inmunoensayos sensibles, existe la posibilidad de obtener resultados positivos que no se repitan.

5 Resultados esperados La prevalencia de la infección por HIV en adultos (edades de años) varía ampliamente en diferentes regiones geográficas desde menos del 0,1% en Asia oriental a 1,0% en el Caribe, pero con la excepción de una prevalencia del 5,2% en el África subsahariana, con máximos del 25% en algunos países. La prevalencia estimada de HIV en Europa oscila entre menos del 0,1% en regiones de Centroeuropa y más del 1,0% en regiones de la antigua Unión Soviética. 3 Características funcionales NOTA: los datos siguientes son representativos; los resultados en experimentos aislados pueden variar respecto a estos datos. Especificidad La evaluación de especificidad se realizó probándose muestras de suero de donantes de sangre no seleccionados, incluidos donantes de primera vez y de pacientes ingresados. Se probaron un total de 9994 muestras frescas de sueros no seleccionados procedentes de dos bancos de sangre, de los cuales 5060 eran del Banc de Sang i Teixits de Catalunya (España) y 4934 del Centro EFS Atlantique de Tours (Francia). Además, se evaluaron también 499 muestras no seleccionadas de suero de pacientes del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (España). Las muestras repetidamente reactivas fueron re-analizadas utilizando una prueba de referencia. La especificidad se calculó, obteniéndose los resultados mostrados en la siguiente tabla: Donantes de sangre de dos bancos de sangre diferentes Muestras analizadas Inicialmente reactivas (IR) Repetidamente reactivas (RR) RR que eran indeterminadas RR que eran positivas confirmadas Especificidad n n n n n % ,6% Pacientes hospitalizados ,8% Sensibilidad La sensibilidad se evaluó examinando muestras con positividad verificada a HIV, algunas de ellas en el Prince Leopold Institute of Tropical Medicine de Amberes (Bélgica). La sensibilidad fue calculada para cada grupo de muestras, obteniéndose los resultados mostrados en la siguiente tabla: Muestras Muestras Grupo de muestras analizadas reactivas Sensibilidad n n % anti-hiv-1 subtipo A (Grupo M) % anti-hiv-1 subtipo C (Grupo M) % anti-hiv-1 subtipo D (Grupo M) % anti-hiv-1 subtipo F (Grupo M) % anti-hiv-1 subtipo G (Grupo M) % anti-hiv-1 subtipo H (Grupo M) % anti-hiv-1 subtipo J (Grupo M) % anti-hiv-1 subtipo K (Grupo M) % anti-hiv-1 subtipos mixtos (Grupo M) % anti-hiv-1 Grupo O % anti-hiv % anti-hiv % Mismo día ( 1 día después de la recolección de las muestras) % Sensibilidad para seroconversión La sensibilidad diagnóstica durante el periodo de seroconversión se evaluó analizando muestras de 30 paneles de seroconversión HIV comerciales: 25 de BBI Diagnostics (SeraCare) y 5 de Zeptometrix. En comparación con la mayoría de los métodos comerciales, se observó una reactividad equivalente con 25 paneles, mientras que se observó una reactividad temprana con 5 paneles. El estudio de 30 paneles de seroconversión demuestra que los resultados cumplen las Especificaciones Técnicas Comunes CE (2009/886/CE).

6 Precisión Se evaluó, conforme a las directrices CLSI EP05-A2, la precisión intra-ensayo y total (ensayo a ensayo y día a día) en múltiples ensayos. Los resultados se resumen en la tabla siguiente: Media (S/CO) Intra-ensayo Total Control negativo 0,27 0,039 SD 0,064 SD anti-hiv-1 Control positivo 3,43 2,57% CV 4,42% CV anti-hiv-2 Control positivo 3,42 3,52% CV 4,56% CV Alrededor del valor de corte 1,06 5,13% CV 7,60% CV Reproducibilidad Se evaluó la reproducibilidad entre réplicas, entre lotes y entre instrumentos usando 55 muestras. Los resultados se muestran en la tabla siguiente: n Co-negatividad Co-positividad Réplica 2 vs. Réplica % 100% Lote 2 vs. Lote % 100% Instrumento 2 vs. Instrumento % 100% Interferencias Estudios conforme a las directrices CLSI EP7-A han demostrado que las siguientes sustancias potencialmente interferentes no alteran los resultados de BIO-FLASH anti-hiv 1+2: Sustancia potencialmente interferente Concentración % Interferencia Hemoglobina 500 mg/dl 10 Bilirrubina indirecta 18 mg/dl 10 Bilirrubina directa 18 mg/dl 10 Triglicéridos 1300 mg/dl 10 Factor reumatoide 800 UI/mL 10 HAMA 1 µg/ml 10 Reactividad cruzada Fueron analizadas con el ensayo BIO-FLASH anti-hiv 1+2 un total de 107 muestras positivas para condiciones que potencialmente podrían producir reacción cruzada y de mujeres embarazadas. Se considera que ocurre una reacción cruzada cuando el diagnóstico cambia de positivo a negativo o viceversa. Las muestras reactivas se compararon con un ensayo de referencia para el que no se observó reactividad cruzada con sustancias potencialmente interferentes. Se confirmó una muestra reactiva para HIV. Los resultados se resumen en la siguiente tabla: Reacción cruzada potencial Concordancia ANA (anticuerpos antinucleares) 7/7 anti-cmv IgG (anticuerpos IgG frente a Citomegalovirus) 5/5 anti-cmv IgM (anticuerpos IgM frente a Citomegalovirus) 4/4 anti-ebv (anticuerpos frente al virus Epstein-Barr) 3/3 anti-e.coli 8/8 anti-hcv (anticuerpos frente al virus de la Hepatitis C) 5/5 Anti-HSV 1 IgG (anticuerpos frente al virus Herpes simplex tipo 1) 5/5 Anti-HSV 2 IgG (anticuerpos frente al virus Herpes simplex tipo 2) 5/5 anti-rubella 5/5 anti-vzv IgG (anticuerpos IgG frente al virus de la Varicela Zoster) 3/3 anti-vzv IgM (anticuerpos IgM frente al virus de la Varicela Zoster) 3/3 IgG elevadas 4/4 IgM elevadas 3/3 HBsAg (antígeno de superficie del virus de Hepatitis B) 5/5 HTLV (Virus linfotrópico T humano) 5/5 Mononucleosis 9/9 Mujeres embarazadas (multíparas incluidas) 9/9 RF (Factor Reumatoide) 4/4 RPR (Reagina plasmática rápida) 5/5 anti-toxo IgG (anticuerpos IgG frente a Toxoplasma gondii) 5/5 anti-toxo IgM (anticuerpos IgM frente a Toxoplasma gondii) 5/5

7 Límite de detección y sensibilidad analítica Conforme a las directrices CLSI EP17-A, el límite de detección (LD) se sitúa en 0,48 S/CO. El ensayo del British Working Standard for anti-hiv 1 (Estándar británico de trabajo para anti-hiv-1) (código NIBSC 99/ ) con el ensayo BIO-FLASH anti-hiv 1+2 presentó 6,49 S/CO y el 1 in 5 dilution British Working Standard for anti-hiv 1 (Dilución 1 a 5 del Estándar británico de trabajo para anti-hiv-1) (código NIBSC 99/ ) 1,28 S/CO. La Monitor Sample for anti-hiv-2 (muestra control para anti-hiv-2, NIBSC código 999/ ) presentó un resultado de 5,44 S/CO con el BIO-FLASH anti-hiv 1+2. Efecto de prozona El BIO-FLASH anti-hiv 1+2 es un ensayo de dos pasos. El protocolo del ensayo incluye un lavado después de la incubación de la muestra, lo que elimina el efecto de prozona. Experimentalmente no se observó ningún efecto de prozona con una muestra tan alta como S/CO.