1. Análisis Teórico Microscopio Óptico Teoría de Formación de Imágenes de Abbe. Resolución. Laboratorio de Ondas y Óptica.

Transcripción

1 Laboratorio de Ondas y Óptica Práctica N 7 Microscopía Óptica Digital Departamento de Física, FaCyT. Universidad de Carabobo, Venezuela. Objetivos Estudiar el funcionamiento de un Microscopio Óptico Preparación de muestras en el laboratorio Procesamiento de las Imégenes obtenidas en el Microscopio Óptico 1. Análisis Teórico 1.1. Microscopio Óptico El conocimiento de las estructuras del ser vivo está basado casi totalmente en el estudio con el microscopio siendo un instrumento que permite la observación de objetos y detalles de estructuras tan pequeñas que no podrían ser observadas a simple vista. Con él, nuestro grado de visibilidad se amplía en cientos o miles de veces, gracias a un conjunto de lentes, dispuestos convenientemente. Las principales dificultades en la observación y estudio de estructuras biológicas son su REDUCIDO TAMAÑO Y SU TRANSPARENCIA a la luz visible. Dado que el microscopio permite superar estas dos dificultades, su uso y el conocimiento de los principios y técnicas en microscopía, resultan fundamentales para el desarrollo de la investigación en diversas áreas de las Ciencias. En la Actualidad la digitalización de una imagen electrónica o de video capturada por un microscopio óptico permite obtener un incremento espectacular en las posibilidades de ampliar características, extraer información o modificar la imagen. En comparación con el mecanismo tradicional de capturación de imágenes, la fotomicrografía en película, la digitalización de la imagen y el proceso de postadquisición/recuperación permiten una modificación reversible de la imagen como matriz ordenada de enteros fundamentalmente libre de ruido más que una mera serie de variaciones análogas en color e intensidad Teoría de Formación de Imágenes de Abbe. Resolución El diseño y construcción de las lentes de los microscopios ha alcanzado un desarrollo tal que en la práctica se puede alcanzar el límite de resolución teórico establecido en la teoría de formación de imágenes de Abbe considerando los efectos de difracción en una lente (ver Fig.1). Una lente objetiva de apertura numérica NA = nsenθ, puede resolver dos puntos en el plano del objeto cuando su separación es mayor que S min =

2 0,61λ NA, donde λ es la longitud de onda de la luz usada y n, el índice de refracción del medio. Es obvio de la expresión anterior que la resolución puede ser mejorada mediante tres formas. Utilizando radiación de menor longitud de onda; aumentando el índice de refracción del medio (n) como en los objetivos de inmersión de aceite; y fínalmente incrementando la apertura angular de la lente. Figura 1. Teoría de Abbe sobre la resolución Formación de Imágenes en el Microscopio El microscopio compuesto (ver Fig. 2) se utiliza para examinar objetos muy pequeños situados a distancias muy cortas. En su forma más simple está formado por dos lentes convergentes: La lente más cercana al objeto O 1, denominada objetivo, forma una imagen real O 2, invertida y mayor que el objeto. La lente más próxima al ojo, denominada ocular, se utiliza como una simple lupa para observar la imagen O 2 formada por el objetivo. El ocular se coloca de tal forma que la imagen O 2 formada por el objetivo caiga en el punto focal del ocular. En consecuencia, la luz emerge del ocular en forma de haz paralelo como si procediese de un punto situado a una gran distancia delante de la lente produciendo una imagen final O 3, que aparece invertida con respecto al objeto O 1.y de mayor tamaño Contraste Figura 2. Formación de imágen en un Microscopio Óptico. Es importante distinguir entre la presencia de un objetivo (visibilidad) y la habilidad para determinar su forma y dimensión (resolución). El limite de la percepción parece estar condicionada tanto por la intensidad de la luz en la imagen (una apertura numérica ayuda a la percepción y a la resolución) y por el contraste.

3 Este ultimo pude ser defínido como 1.5. Profundidad de Campo y Profundidad de Foco Contraste = I fondo I objeto I fondo (1) La profundidad de campo y la profundidad de foco en un microscopio son dos cantidades que están relacionadas, pero que frecuentemente son confundidas. La profundidad de campo, D1 esta definida en el espacio del objeto y es la distancia medida en relación al objetivo, respecto a la cual dos objetos diferentes pueden ser bien definidos en la imágen. Esto es ilustrado en al Fig. 3, D1 es el rango en el cual diferentes partes del objeto son enfocados efectivamente al mismo 1 tiempo. Se puede demostrar que D1 es proporcional a, y que para objetivos de alta potencia es del (NA) 2 mismo orden de magnitud al límite de difracción. Figura 3. Esquema de Profundidad de Campo y de Foco. El termino profundidad de foco es frecuentemente utilizado en vez de profundidad de campo para describir D1. Sin embargo este uso es incorrecto y la profundidad de foco D2, se refiere estrictamente a la distancia equivalente en el espacio de la imágen. Este término tiene poca relevancia cuando la imagen final esta siendo visualizada por el ojo porque este tiene su propio poder de acomodación. Donde es relevante es cuando se utiliza una pantalla o una cámara ccd o fotográfica para registrar la imagen final Propiedades Básicas de las Imágenes Digitales Las imágenes de señal continua se reproducen mediante dispositivos electrónicos analógicos que registran los datos de la imagen con precisión utilizando varios métodos, como una secuencia de fluctuaciones de la señal eléctrica o cambios en la naturaleza química de la emulsión de una película, que varían continuamente en los diferentes aspectos de la imagen. Para procesar o visualizar en el ordenador una señal continua o una imagen analógica, se debe convertir primero a un formato comprensible para el ordenador o formato digital. Este proceso se aplica a todas las imágenes, independientemente de su origen, complejidad y de si son en blanco y negro (escala de grises) o a todo color. Una imagen digital se compone de una matriz rectangular (o cuadrada) de píxeles que representan una serie de valores de intensidad ordenados en un sistema de coordenadas (x,y).

4 2. Actividad Práctica 2.1. Identifique las lentes objetivas del microscopio metalográfico y completa la siguiente tabla. Para llenar esta tabla use la información que se muestras en la Figura 4: Figura 4. Información suministrada por la lente Objetiva 2.2. Mediciones cuantitativas bidimensionales Las mediciones reales de pequeños objetos en el plano pueden ser realizadas con una escala o un micrómetro en el ocular, mediante patrones comparadores o mediante una fotografía aumentada. En todos los casos las mediciones son en unidades relativas. Para obtener el tamaño absoluto se debe medir el valor del aumento. Cuando se miden pequeñas partículas las limitaciones de la difracción se aplican independientemente en el plano del objeto; de allí que la resolución máxima corresponde a un área mínima s 2.

5 Sin embargo cuando se miden partículas con áreas mayores que s 2 las cuales tiene lados paralelos (como en algunos cristales) es posible lograr una mejor resolución en una dimensión. Esto depende del efecto vernier acuity ; dos líneas paralelas pueden ser mejor alineadas con mayor exactitud que s min Profundidad de Foco Observe algunas muestras con rugosidades superficiales y mediante el ajuste fino de la altura de la plataforma, compruebe como la profundidad de foco es mayor para objetivos de mayor apertura numérica. Tanto estar en foco como fuera de foco tiene que ser a juicio del ojo así que el método tiene aplicaciones limitadas Contraste Observe las propiedades de la imágen obtenida de una muestra de biotita variando la apertura en la fuente de iluminación. Utilice los filtros de luz monocromática Polarización Observe diferentes muestras que posean estructuras cristalinas como la azucar, sal o esmulsiones ; también podria usar una muestras superpuestas de cinta plastica mediante la técnica de microscopia de polarización. Rote la muestra para alterar la orientación de los cristales con respecto a la luz incidente Procesamiento de Imégenes 1. Usando las muestras de Aluminio en polvo, Cobre en polvo, Arena de playa, Azucar y sal; estas ultimas la tendrá que preparar usted en el laboratorio. Capture las imágenes obtenidas con el microscopio y realice con el programa ImageJ un conteo y estimación del tamaño de las Partículas. 2. Realizar el levantamiento topográfico de las imágenes. 3. Detectar los bordes de las muestras. 3. Cuestionario 1. Cuáles son las aberraciones de las lentes ópticas? 2. Utilice la ecuación de las lentes delgadas para demostrar que la relación entre la profundidad de campod 1 y la profundidad de foco esta dad por D 1 = m 2 D 2, donde m 2 es el aumento lineal de la lente. 3. Realice un esquema comparativo entre el microscopio óptico y el microscopio electrónico de transmisión. Nota Es importante registrar digitalmente con la cámara todos los fenómenos observados Los lentes objetivos y oculares no deben ser tocados con los dedos porque se deterioran Usar guantes de laxtes