LEVADURAS DE INTERÉS MÉDICO PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

Transcripción

1 LEVADURAS DE INTERÉS MÉDICO PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

2 Levaduras de Importancia Médica Levaduras del género Candida Levaduras del género Cryptococcus Levaduras del género Malassezia Levaduras del género Trychosporon Levaduras del género Rhodotorula Levaduras del género Saccharomyces

3 Identificación de levaduras del género Candida

4 Levaduras del género Candida Agentes de candidiasis superficiales y profundas. Más de 150 especies descritas: C.albicans, C.tropicalis, C. famata, C.parasilopsis C.lipolytica, C.glabrata, C.krusei,C.lusitaniae, C.dubliniensis, etc.

5 Levaduras del género Candida Qué importancia tiene identificar las especies? Aumento de la incidencia de las candidiasis sistémicas. Aumento en la frecuencia en la aparición de especies de Candida no albicans Resistencia a antifúngicos

6 Identificación de Levaduras del género Candida Estudio macro y micromorfológico de las colonias. Termotolerancia Sensibilidad a la cicloheximida (Micobiotic) Pruebas biológicas Pruebas bioquímicas Métodos enzimáticos Identificación del genotipo

7 Identificación de levaduras del género Candida Estudio macroscópico de la colonia: Colonias blanquecinas, opacas, cremosas, lisas, rugosas, cerebroides.

8 Identificación de levaduras del género Candida Estudio microscópico de la colonia (ex. fresco, Gram): Levaduras ovaladas, 3-5 µ, con pseudofilamentos, producción de pseudomicelio o micelio verdadero, Gram (+)

9 Identificación de levaduras del género Candida Aislamiento de una levadura no capsulada y sin pigmento Siembra en Agar Harina de Maíz (clamidosporos +) Siembra en Suero Humano Normal (tubos germinales +) Siembra en Agar Harina de Maíz (clamidosporos -) Siembra en Suero Humano Normal (tubos germinales -) Candida albicans Candida no albicans Auxanograma Zimograma (Prueba de asimilación de Hidratos de Carbono) Prueba de fermentación de Hidratos de Carbono

10 Identificación de levaduras del género Candida: Pruebas biológicas Tubos germinales: Se utiliza un repique de 24 hs. Suspensión en suero humano, conejo, oveja, caballo. Incubación a ºC por 2-4 hs. Ventajas: bajo costo, fácil realización, resultado rápido. Desventajas: Aprox. 5 % de las cepas de C. albicans no los producen. Requieren para su observación, personal experimentado

11 TUBOS GERMINALES

12 Identificación de levaduras del género Candida: Pruebas biológicas Producción de clamidosporos: Se utilizan medios pobres AHM-Tween 80 Estructuras de resistencia Se utilizan repiques de 24 hs. Se observan a las 72 hs. hasta los 7 días. Personal experimentado 5-7% de las cepas de C. albicans no los producen Son de bajo costo

13 CLAMIDOSPOROS

14 Agar morfología en placa Agar leche

15 Identificación de Levaduras del género Candida: Pruebas bioquímicas Asimilación de hidratos de carbono Auxanograma convencional Zimograma convencional Sistemas comerciales de identificación Métodos enzimáticos Fluorogénicos Cromogénicos

16 Auxanograma Método de estudio bioquímico para identificación de levaduras del género Candida. Asimilación de carbohidratos en aerobiosis. Repiques de 24 hs de la cepa a estudiar. Lectura luego de 24 hs a 48 hs previo pasaje por estufa a 37 C. Halo de crecimiento alrededor del disco, evidencia asimilación del carbohidrato.

17 Auxanograma convencional

18 Zimograma convencional Método de estudio bioquímico para identificación de levaduras del género Candida. Asimilación de carbohidratos en anaerobiosis. Medio líquido alcalino con indicador de Ph. Repiques de 24 hs. Lectura a las 24 a 48 hs, previo pasaje por estufa a 37 C.

19 Identificación de levaduras del género Candida: API METODOS BIOQUIMICOS

20 Interpretación:

21 Identificación de levaduras del género Candida Métodos enzimáticos Se detectan 2 enzimas: L-prolina aminopeptidasa y βgalactosaminidasa mediante métodos fluorogénicos y cromogénicos. * Tienen buena sensibilidad y especificidad * Lectura entre 5 minutos 48 hs. de incubación * Adecuados para la identificación de C.albicans

22 Métodos Enzimáticos Ventajas: - No requieren personal especializado para su lectura. - Permiten la identificación rápida de C.albicans. Desventajas - Requieren de gran presición (flurogénicos)

23 Medios Cromógenos

24 Medios Cromógenos CHROMagar Candida Candida ID/ID2 Agar Biggy CHROMalbicans Albicans ID

25 CHROMagar Candida Medio ampliamente difundido en nuestro medio Identificación de levaduras del género Candida Diagnóstico de especie mediante el desarrollo de colonias pigmentadas de diferentes colores

26 CHROMagar Candida

27 Evaluación del medio cromógeno CHROMagar CandidaTM para la indentificación de levaduras de interés médico Objetivo (I) Determinar la sensibilidad y especificidad diagnóstica del CHROMagar Candida, con respecto a la metodología convencional para la identificación de levaduras del género Candida Objetivo (II) Evaluar el comportamiento del método CHROMagar Candida cuando se incluyen levaduras de otros géneros como Cryptococcus, Trichosporon y Rhodotorula en dicho medio

28 CONCLUSIONES El medio es confiable sobre todo para la identificación de C. albicans. Recomendamos utilizar dicho medio para identificar especies de Candida luego de tener certeza de que la cepa pertenece a éste género (como lo especifica el fabricante). Por tanto no es posible prescindir del estudio morfológico. Es necesario utilizar otra metodología para la identificación precisa de las especies de Candida no albicans identificadas por este medio. No es conveniente utilizar el medio para el aislamiento primario a partir de especímenes biológicos, porque induce a resultados falsos positivos, fundamentalmente cuando identifica a las especies como no albicans. Es de destacar que el medio facilita el reconocimiento de distintas especies que pueden coexistir en la misma muestra.

29 Candida ID/Candida ID2 Medio cromógeno: Aislamiento selectivo de levaduras e identificación de C. albicans Colonias de C. albicans: azul hidrólisis específica de la hexosaminidasa (sustrato cromogénico). Colonias rosadas: hidrólisis de otro sustrato que sirve para diferenciar otras levaduras Lectura: hs. Apropiado para separar cultivos mixtos ID2 = (-) bacterias

30 Candida ID

31 Albicans ID C.albicans

32 Agar Biggy

33 Identificación de levaduras del género Candida Aglutinación de partículas de látex Las partículas están recubiertas de Ac monoclonales que se unen específicamente con Ag de C. albicans y C. krusei Son métodos rápidos Sensibles y específicos No requieren personal entrenado MUY COSTOSOS

34 Identificación de levaduras del gen. Candida Técnicas de biología molecular Se basan en PCR - Más rápidos para la identificación de Candida spp. que los métodos fenotípicos. - Permite identificar aquellas especies que no han podido ser determinadas por métodos fenotípicos - Muy costosos - No son aplicables a laboratorios clínicos - Laboratorios de referencia - Requiere personal especializado -

35 Gracias