Estrategias de evaluación de antioxidantes en extractos vegetales

Transcripción

1 Estrategias de evaluación de antioxidantes en extractos vegetales Dr. Gustavo E. Zúñiga Laboratorio de Fisiología y Biotecnología Vegetal Departamento de Biología Facultad de Química y Biología Universidad de Santiago de Chile gzuniga@usach.cl yyyyyy 1

2 Tópicos Estrés oxidativo /Especies reactivas de oxigeno Modo de acción de antioxidantes Medición de antioxidantes yyyyyy 2

3 Estrés oxidativo y especies reactivas de oxigeno estrés oxidativo: acumulación de especies reactivas de oxigeno (ROS), que provocan daño celular. ROS O 2 O 2. H 2 O 2. OH + OH - H2O superoxido peroxido radical hidroxilo yyyyyy 3

4 Fuentes de ROS Ambientales Humo de cigarrillos, polución, ozono de superficie Radiación UV Condiciones de estrés en Plantas. Endógenas Enzimas Sistema de transporte de electrones interacción de ROS con metales de transición yyyyyy 4

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6 Sistemas antioxidantes Antioxidantes primarios. Liposolubles: tocoferoles, ubiquinoles, carotenoides. Hidrosolubels: ascorbato, glutation, ácido úrico, etc Antioxidantes secundarios Enzimas: SOD, APx, POD, CAT, etc Fitoquímicos. yyyyyy 6

7 Antioxidantes de plantas Derivados de isoprenoides Carotenoides, tocoferoles Sustancias fenolicas Polifenoles, flavonoides Sustancias derivadas de aminoacidos Glutation Acidos grasos y lipidos insaturados yyyyyy 7

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14 Estructura de polifenoles A and B son anillos fenolicos O A C 5 4 2' 1' 2 3 3' B 6' 4' 5' C es un anillo heterociclico Los polifenoles difieren en el estado de oxidacion del anillo C yyyyyy 14

15 Flavanoles OH OH HO O OH OH yyyyyy 15

16 Flavonoles OH OH HO O OH O OH yyyyyy 16

17 Flavonas OH O H HO O OH O yyyyyy 17

18 Antocianinas OH OH HO + O OH OH yyyyyy 18

19 Isoflavonas yyyyyy 19

20 Modo de acción de antioxidantes Primarios. Interrumpen la reacción en cadena generando un radical menos activo ROO + AH ROOH + A ROO + A ROOA Secundarios. Preventivos Quelantes. Desactivan metales Removedores de ROS Atrapadores de oxigeno singlete yyyyyy 20

21 Atrapamiento de metales yyyyyy 21

22 Atrapamiento de radicales yyyyyy 22

23 METODOS DE EVALUACION Existen diferentes métodos para determinar la actividad antioxidante de plantas. Medición del contenido de fenoles. Folin-Ciocalteau Medición de antocianinas Capacidad atrapadora de radicales. Capacidad antioxidante total yyyyyy 23

24 Contenido de fenoles Se basa en el uso del reactivo de Folin- Ciocalteu. Una alícuota del extracto se mezcla con el reactivo diluido (5-10 veces) (1:1, 1:5). Se agrega además 5 volúmenes de carbonato de sodio 10% Se incuba a 50 C durante 5 minutos. Se enfría y se lee absorbancia a 760 nm. Se usa como estándar ácido galico. yyyyyy 24

25 Contenido de antiocianinas Extraer en metanol con 1% de HCl a 4 C durante 24 hrs. Medir absorbancia a 530 nm y expresar como equivalentes de cianidina usando un ε yyyyyy 25

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27 Análisis de flavonas y flavonoles Tomar extracto y disolver en agua. Tomar alícuota de esta fracción y agregar HCl 6M y Alcohol puro. Calentar durante media hora y enfriar. El contenido de flavonas y flavonoles se determina mediante HPLC. yyyyyy 27

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29 Actividad atrapadora de radical hidroxilo Preparar una solución que contenga 0,2 m de benzoato de sodio (10 mm), 0,2 ml de FeSO 4 x 7H 2 O (10 mm) y 0,1 ml de EDTA (10 mm). Llevar a un volumen final con 1,8 ml de buffer fosfato (ph 7,4 0, M) Agregar 0,2 ml H 2 O 2 (10 mm) Incubar a 37 C x 2 hrs Medir fluorescencia a 407(emisión) y 305 (excitación) yyyyyy 29

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31 Actividad atrapadora de radical superoxido O - 2 Preparar 3 ml de una solucion con: buffer fosfato 50 mm (ph 7,8), metionina 13 mm, rivoflavina 2 µm, EDTA 100 µm, NBT 75 µm Agregar 0,5 ml de la muestra Medir aumento de la absorbancia a 560 nm, durante 10 min mientras se ilumina con lampara fluorescente. yyyyyy 31

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33 Actividad atrapadora de Radicales DPPH Solución de DPPH (0,04%) en MeOH Agregar alícuota de extracto Medir Absorbancia a 517 nm durante 30 min. yyyyyy 33

34 Capacidad atrapadora de radicales yyyyyy 34

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38 Capacidad antioxidante equivalente a trolox (TEAC) Se basa en la capacidad del antioxidante para atrapar el radical cationico 2,3 azinobis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonate) (ABTS + ) Se mide desaparición del catión a 734 nm. Se usa como estándar trolox yyyyyy 38

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41 Determinación de la capacidad antioxidante total Mezclar 0,1 ml de extracto con 2 ml de solución reactiva (ácido sulfúrico 0,6 M, fosfato de sodio 28 mm y molibdato de amonio 4 mm) Incubar a 95 C durante 90 min Leer absorbancia a 695 nm. Estándares Ácido ascórbico o ácido gálico. yyyyyy 41

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43 Gracias yyyyyy 43

44 Ferric reducing/ antioxidant power (FRAP) Se basa en la capacidad reductora del antioxidante. Fe +3 Fe +2 Fe +2 /2,4,6 tripiridil-s-triazina complejo azul A 593 Complejo azul /antioxidante Decae A 593 yyyyyy 44

45 Sistema β-caroteno- acido linoleico (β- CLAMS) Este método se basa en la decoloración del β- caroteno por la accion de peroxidos originados durante la oxidacion de acido lonoleico. Se lee la absorbancia a 490 nm entre 0 y 15 min. yyyyyy 45

46 Capacidad de absorción de radicales de oxigeno (ORAC) Se utiliza una proteína fluorescente, R- ficoeritrina (R-PE) y un generador de radicales peroxido, 2,2-azobis(2-amidinopropano) dihidrocloruro. Se mide a 540 nm (excitación) y 565 nm (emisión). yyyyyy 46