DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS FUNDAMENTOS DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL. 3ª RELACIÓN DE PROBLEMAS.

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1 FUNDAMENTOS DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL. 3ª RELACIÓN DE PROBLEMAS. 1.- En ausncia d autoabsorción, la intnsidad d fluorscncia d una mustra s proporcional a la concntración, solo a concntracions bajas. Calcular l porcntaj d rror qu s comt suponindo qu la rspusta s linal cuando s mid la intnsidad rlativa d fluorscncia d disolucions y M d un compusto cuya ε=4 L mol -1 cm -1 si l valor d b s 1 cm. Solución: c= M: %; c= M;.88 % 2.- S dsa analizar vitamina B 1 n un prparado comrcial d 2. g por l método dl tiocromo. S tra con HCl y fosfatasa y s diluy a 1 ml. S purifica una alícuota d 15 ml pasándola por una columna cromatográfica, y por causas inhrnts al procso s diluy a 25 ml. D la antrior solución, s forman dos porcions d 5 ml, una d llas s trata con frricianuro y ambas s aforan a 1 ml para amn fluorimétrico. Una solución d rfrncia d.2 ppm d tiamina s somt al mismo trataminto qu la mustra problma, con cpción d qu la porción introducida n la columna consrva su volumn original. S toman dos alícuotas d 5 ml y una s oida y ambas s aforan a 1 ml. S mid la fluorscncia d ambas mustras dando lugar a intnsidads d fluorscncia d 18 y 13 unidads d fluorscncia, rspctivamnt. Calcular los ppm d vitamina B 1 n la mustra. Solución: 23 ppm 3.- La forma rducida dl dinuclótido d nicotinamida y adnina (NADH) s una conzima important y muy fluorscnt. Tin un máimo d absorción d 34 nm y un máimo d misión a 465 nm. Las solucions patrón d sta sustancia gnran las siguints intnsidads d fluorscncia: Concntración d NADH Intnsidad rlativa (µmol/l) a) Trazar la curva d calibración dl NADH. b) Dtrminar la pndint y ordnada n l orign por mínimos cuadrados para la gráfica dl apartado antrior. c) Calcul la dsviación stándar d la pndint y la qu corrspond a la rgrsión d la curva. d) Una solución dsconocida tin una fluorscncia rlativa d Cuál srá su concntración n NADH? Calcular la dsviación la dsviación stándar rlativa dl rsultado obtnido, así como la dsviación stándar rlativa dl rsultado obtnido considrando qu l valor d s la mdia d trs mdidas. Solución: b) I rl =22.35 c NADH ; c) s y/ =.1747, s b =.2696; d) c=.544 µm, DER=1.86 %; DER (con rplicados)=1.2 %

2 4.- En algunos métodos fluorimétricos, l amortiguaminto d la fluorscncia s proporcional a la concntración d las spcis dsadas, por jmplo, l mtal X pud suponrs qu amortigua la fluorscncia dl ligando L. En una sri d mdidas s obtuviron los siguints datos: Solución Sñal fluorscnt L (M) X (M) Blanco Encuntr: a) La rlación molar dl compljo formado ntr X y L. b) La concntración d X n una solución, la cual, cuando s trata n la misma forma, da una lctura d 26.8 unidads. Solución: M 5.- A cuatro alícuotas d 1, ml d una mustra d agua s adicionaron., 1., 2. y 3. ml d una solución stándar d NaF qu contnía 1. ppb d F - tal y como s mustra rsumido n la tabla. S adicionaron a cada una 5. ml actos d una solución qu contnía un cso d compljo d Al con l rojo d Alizarina R, un compljo furtmnt fluorscnt, y las disolucions s diluyron a 5. ml. La intnsidad d d fluorscncia d las cuatro disolucions y d un blanco furon las siguints: ml d Mustra ml d F - stándar (1. ppb F-) ml Compljo Alrojo Alizarina R (c) Lctura Blanco, a) Rprsntar los datos y obtnr la cuación d la rcta por mínimos cuadrados b) Calcular los ppb d F - n la mustra

3 1.- En ausncia d autoabsorción, la intnsidad d fluorscncia d una mustra s proporcional a la concntración, solo a concntracions bajas. Calcular l porcntaj d rror qu s comt suponindo qu la rspusta s linal cuando s mid la intnsidad rlativa d fluorscncia d disolucions y M d un compusto cuya ε=4 L mol -1 cm -1 si l valor d b s 1 cm. Solución: c= M: %; c= M;.88 % Tóricamnt, la intnsidad d fluorscncia,i F, s proporcional a la ficacia cuántica, Φ, y a la intnsidad d radiación absorbida por la mustra (I -I), difrncia ntr la intnsidad incidnt y la intnsidad transmitida: I F = KΦ(I -I) Por otra part, la Transmitancia s dfin como la rlación ntr la Intnsidad transmitida, I, y la intnsidad incidnt I, sindo la Absorbancia, A, l logaritmo dcimal d la transmitancia cambiado d signo: I T = I = I * T I A = εbc = logt T = 1 A = 1 εbc Por tanto: I F = KΦ(I -I 1 -εbc ) = KΦI (1-1 -εbc ) 1 -εbc s pud aproimar, a concntracions bajas a la sri d Taylor. Para llo s ncsario hacr un cambio d bas: 1 = ln1 = 2.33, por tanto: 1 -εbc = ( 2.33 ) -εbc = -2.33εbc El dsarrollo d la sri d Taylor para cuando tind a cro s: 2 3 n n f ( ) f () f '() f ''() f '''()... f () = = 1! 2! 3! n! = D tal manra qu, cuando tind a cro (bajas absorbancias): i i f i! i () = + 1! + 2 2! + 3 3! n n! = ! + 3 3! n n! Entoncs: 2.33εbc = εbc + (2.33εbc) 2! 2 (2.33εbc) 3! (2.33εbc) n! n

4 Si la absorbancia s pquña, (A <.5) s pudn dsprciar los términos d ordn 2 y supriors, por tanto: -2.33εbc εbc y la intnsidad d fluorscncia aproimada; I Fapro = 2.33KΦI εbc = K c (proporcional a la concntración) El porcntaj d rror qu s comt: I I I = 1* IF 2.33εbc 2.33A 1 = 1* 1 = 1* εbc Fapro F Fapro % E = 1* 1 A IF - Si la concntración s M: εbc = 4*1* =.1 qu supra l valor d *.1 1* 1 = 11.95%. 1 1 % E = 1 - Si la concntración s M: εbc = 4*1* =.1 qu stá por dbajo dl umbral d.5 d absorbancia. 2.33*.1 1* 1 = 1.17%. 1 1 % E = 1

5 2.- S dsa analizar vitamina B 1 n un prparado comrcial d 2. g por l método dl tiocromo. S tra con HCl y fosfatasa y s diluy a 1 ml. S purifica una alícuota d 15 ml pasándola por una columna cromatográfica, y por causas inhrnts al procso s diluy a 25 ml. D la antrior solución, s forman dos porcions d 5 ml, una d llas s trata con frricianuro y ambas s aforan a 1 ml para amn fluorimétrico. Una solución d rfrncia d.2 ppm d tiamina s somt al mismo trataminto qu la mustra problma, con cpción d qu la porción introducida n la columna consrva su volumn original. S toman dos alícuotas d 5 ml y una s oida y ambas s aforan a 1 ml. S mid la fluorscncia d ambas mustras dando lugar a intnsidads d fluorscncia d 18 y 13 unidads d fluorscncia, rspctivamnt. Calcular los ppm d vitamina B 1 n la mustra. Solución: 23 ppm Como l trataminto dl patrón y d la mustra problma son idénticos, salvo la dilución d 15 a 25 ml n la columna cromatográfica, hacmos rfrncia a la concntración d patrón d.2 ppm d tiamina, qu da una fluorscncia d 13 unidads. Por tanto, 18 unidads d fluorscncia s corrspondn a una concntración d tiamina d: 18*.2/13 =.2769 ppm Esta concntración db sr corrgida por la clusiva dilución cromatográfica qu sufr la mustra problma. Lugo la concntración d tiamina n los 1 ml s:.2769 * 25/15 =.4615 ppm (mg/l) Para obtnr los mg d tiamina n la mustra, s multiplica la concntración por l volumn prsado n litros: mg d tiamina n 1 ml o 2 gramos d mustra =.4615 (mg/l) *.1 L =.4615 mg. Para obtnr los ppm (mg analito / Kg mustra) d tiamina n la mustra: ppm d tiamina n la mustra =.4615 (mg) / 21-3 Kg = 23.1 ppm (mg/kg o µg/g)

6 3.- La forma rducida dl dinuclótido d nicotinamida y adnina (NADH) s una conzima important y muy fluorscnt. Tin un máimo d absorción d 34 nm y un máimo d misión a 465 nm. Las solucions patrón d sta sustancia gnran las siguints intnsidads d fluorscncia: Concntración d NADH Intnsidad rlativa (µmol/l) a) Trazar la curva d calibración dl NADH. b) Dtrminar la pndint y ordnada n l orign por mínimos cuadrados para la gráfica dl apartado antrior. c) Calcul la dsviación stándar d la pndint y la qu corrspond a la rgrsión d la curva. d) Una solución dsconocida tin una fluorscncia rlativa d Cuál srá su concntración n NADH? Calcular la dsviación la dsviación stándar rlativa dl rsultado obtnido, así como la dsviación stándar rlativa dl rsultado obtnido considrando qu l valor d s la mdia d trs mdidas. Solución: b) I rl =22.35 c NADH ; c) s y/ =.1747, s b =.2696; d) c=.544 µm, DER=1.86 %; DER (con rplicados)=1.2 %

7 4.- En algunos métodos fluorimétricos, l amortiguaminto d la fluorscncia s proporcional a la concntración d las spcis dsadas, por jmplo, l mtal X pud suponrs qu amortigua la fluorscncia dl ligando L. En una sri d mdidas s obtuviron los siguints datos: Solución Sñal fluorscnt L (M) X (M) Blanco Encuntr: a) La rlación molar dl compljo formado ntr X y L. b) La concntración d X n una solución, la cual, cuando s trata n la misma forma, da una lctura d 26.8 unidads. Solución: M M + nl º ML n Obsrvando los datos d intnsidad d fluorscncia s dduc qu: M no s fluorscnt; L s fluorscnt y; ML n no s fluorscnt. Obsrvando igualmnt los datos, s dduc qu n= 1 ya qu s ncsita la misma concntración d ligando qu d mtal inicial para inhibir totalmnt la fluorscncia. Por st motivo, no incluimos la concntración d L d M.

8 5.- A cuatro alícuotas d 1, ml d una mustra d agua s adicionaron., 1., 2. y 3. ml d una solución stándar d NaF qu contnía 1. ppb d F - tal y como s mustra rsumido n la tabla. S adicionaron a cada una 5. ml actos d una solución qu contnía un cso d compljo d Al con l rojo d Alizarina R, un compljo furtmnt fluorscnt, y las disolucions s diluyron a 5. ml. La intnsidad d d fluorscncia d las cuatro disolucions y d un blanco furon las siguints: ml d Mustra ml d F - stándar (1. ppb F-) ml Compljo Alrojo Alizarina R (c) Lctura Blanco, c) Rprsntar los datos y obtnr la cuación d la rcta por mínimos cuadrados d) Calcular los ppb d F - n la mustra El fluoruro dstruy l compljo ntr l aluminio y l rojo d Alizarina por formación d AlF Esto provoca por tanto una disminución d la fluorscncia qu pud srvir, por tanto, para la dtrminación d F -. En st caso, para amortiguar l fcto matriz s propon l método d la adición stándar. Dbido a qu s produc una disminución d la fluorscncia, s ha d buscar l punto d cort ntr la rcta d calibrado y 73 (sñal dl blanco). La concntración d F - n la disolución d mdida cuando s añad, por jmplo, 1 ml d patrón d 1 ppb sobr un volumn final d 5 ml: C 1 *V 1 = C 2 *V 2 ; C 2 =C 1 V 1 /V 2 = 1*1/5 =.2 ppb. Con 2 ml.4 ppb y, con 3 ml.6 ppb. Como la mustra problma s diluy 5 vcs, [F-] = 5* =.361 ppb.