REGULACIÓN DE LOS NIVELES DEL FACTOR ACTIVADOR DE PLAQUETAS COMO FACTOR ETIOLÓGICO EN LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

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1 REGULACIÓN DE LS NIVELES DEL FACTR ACTIVADR DE PLAQUETAS CM FACTR ETILÓGIC EN LA ENFERMEDAD INFLAMATRIA INTESTINAL Investigador principal: Dr. Juan Aguilar Piera Facultat de Farmàcia. UB Duración: 3 años MEMRIA FINAL 1. Resumen El objetivo principal del presente proyecto se centra en la determinación de los mecanismos de regulación de los procesos de síntesis y degradación del factor activador de plaquetas (PAF), agente proinflamatorio involucrado en la enfermedad inflamatoria intestinal. El objetivo se completará con el diseño y preparación de inhibidores de las actividades de síntesis de PAF con posible interés farmacológico. Se propone la identificación de estos mecanismos de regulación en células de epitelio intestinal infectadas por enterobacterias patógenas, en biopsias o muestras de resecciones quirúrgicas de enfermos que presenten enfermedad inflamatoria intestinal. 1

2 2. Resultados 1. Respuesta a la infección en células Caco-2 diferenciadas. Un primer estudio de respuesta a la infección se realizó empleando células Caco-2 no diferenciadas. La determinación de los niveles de PAF, la medida de las actividades enzimáticas involucradas en la síntesis de este mediador y el análisis de la expresión de los genes correspondientes por RT-PCR no mostraron cambios significativos en respuesta a la infección por S. enteritidis o EEC 157:7. Puesto que la expresión y localización de determinados receptores involucrados en la respuesta del enterocito a la infección con bacterias depende del estado de diferenciación de la célula epitelial, hemos abordado los estudios de respuesta inflamatoria en células Caco-2 diferenciadas. La respuesta de estas células en cuanto a producción de PAF fue analizada por medición de los niveles de este mediador en extractos lipídicos de células sometidas a 4 horas de infección con los dos tipos de enterobacterias y en los correspondientes sobrenadantes. Los niveles de PAF celulares se incrementan en la respuesta al patógeno enteroinvasivo S. enteritidis, mientras que no se observan cambios significativos en la infección por EEC 157:7 respecto a células controles. En la infección por S. enteritidis se observan también incrementos del PAF liberado y, por tanto, el incremento de PAF celular va asociado a un incremento de liberación de PAF al medio de cultivo. 2. Estudio en células Caco-2 diferenciadas del mecanismo de producción y liberación de PAF por infección con S. enteritidis. Con el fin de averiguar si la producción de PAF en cultivos de células Caco-2 diferenciadas en respuesta a la infección por S. enteritidis era debida a una activación de la cpla2, se procedió a determinar los niveles de cpla2 mediante técnicas de Western blot tras 4 horas de 2

3 infección. En una primera aproximación, los resultados indicaron que la infección no afecta a los niveles de esta proteína. La cuantificación de la forma fosforilada se realizó empleando un anticuerpo específico que reconoce la cpla2 fosforilada en la Ser505. En este caso tampoco se observaron diferencias entre los niveles de enzima fosforilada. Es probable que las células Caco-2 (de carcinoma de colon) posean niveles constitutivos de cpla2 activada y que la producción de PAF en estas condiciones requiriese exclusivamente un incremento del calcio intercelular provocado por el patógeno. En primer lugar, se comprobó la capacidad de los cultivos diferenciados de células Caco-2 de liberar PAF al medio por estimulación con el ionóforo de calcio A23187 a diferentes tiempos, observándose una liberación significativa del mediador a los 60 minutos de estimulación. También se estudió el efecto del TPA, éster de forbol que provoca la fosforilación de la cpla2. Células Caco-2 incubadas en presencia de TPA no reflejan cambio alguno en los niveles del mediador liberado al medio respecto a los controles. Estos resultados corroboran los obtenidos a través de Western e indican que las células Caco-2 presentan cpla2 fosforilada. La adición simultánea de ionóforo A23187 y TPA producía en estas células niveles de PAF liberado al medio del mismo orden que los liberados en la infección por S. enteriditis, circunstancia que reafirma el resultado anterior. El estudio de la implicación de los niveles de calcio en la producción de PAF se completó en ensayos en los que se empleaba el quelanto intracelular de calcio BAPTA/AM. En presencia del quelanto, los niveles de PAF liberados tras la infección eran similares a los de las células controles, indicando que el calcio es necesario para que el patógeno produzca PAF como respuesta. 3

4 3. Niveles de PAF en mucosa de colon humano infectada por EEC 157:7 o S. enteriditis. Los experimentos que se presentan a continuación completan experimentos realizados con intestino de rata y amplían la información obtenida, en este caso con muestras de tejido humano suministradas por el hospital colaborador. Las muestras son de mucosa de colon humano obtenidas a partir de resecciones quirúrgicas de 5 pacientes (2 hombres y 3 mujeres, con una media de edad de 54 años). La respuesta inflamatoria a la infección fue evaluada por medición de los niveles de IL-8 secretada. Los niveles de PAF se midieron por RIA en extractos lipídicos de los tejidos homogeneizados después de la infección o estimulación por IL-1β. Los niveles de PAF en las muestras de tejido infectadas con EEC 157:7 o S. enteriditis, o estimulados por IL-1β mostraban incrementos estadísticamente significativos comparados con los del control de tejido no estimulado. 4. Estudio de los niveles de PAF en biopsias de enfermos con enfermedad inflamatoria intestinal. Las muestras (de unos 8 a 12 mg) acumuladas a lo largo del estudio han sido procesadas para determinar los niveles de PAF mediante ensayo radioinmune. Las muestras se han clasificado atendiendo a la clínica de los enfermos en: a) colon sano, b) colon con diagnóstico de enfermedad de Crohn, y c) colon en brote de colitis ulcerosa. Los niveles de PAF, que se han determinado en un orden aleatorio para evitar ninguna influencia o desviación, se han utilizado para el estudio estadístico. Se obtuvieron 37 muestras de 26 pacientes, cuyos datos personales y clínicos están preservados por los responsables médicos del equipo. Diecinueve valores que correspondían a sanos se emplearon para obtener la media del valor del nivel de PAF, que resultó ser de 0,79±0,05 ng PAF/mg tejido. Las muestras que correspondían a 4

5 pacientes diagnosticados como enfermos de Crohn mostraron niveles de PAF apreciablemente inferiores (0,44±0,04) a la media de los sanos. Finalmente, las muestras que correspondían a pacientes diagnosticados de colitis ulcerosa mostraron valores (0,86±0,08) muy próximos a la media de los sanos y claramente diferentes del valor que presentan los enfermos de Crohn. bviamente, la falta de un número mayor de muestras de pacientes con enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa no permite asignar ninguna significación estadística a estos datos, aunque parecen bastante indicativas. 5. btención por síntesis orgánica de cuatro glicerolípidos análogos del PAF Respecto a la parte química, conforme a lo que se establecía en el plan de trabajo del proyecto, se han sintetizado tres potenciales inhibidores (1, 2, y 3) de las enzimas de la vía de síntesis de PAF. Todos ellos responden a la estructura de A de la propuesta inicial, donde la cadena de la posición 1 puede ser de 16 ó 18 átomos de carbono, mientras que el sustituyente X de la posición 2 es C 3 C 2 o bien C 3 CN. En todos los casos en la posición 3 se mantiene un resto de fosforilcolina. X 2 C n 2n+1 P - N + Me 3 A 5

6 En el esquema 1 se muestra la vía de síntesis del inhibidor 1. B u 2 S n,c Cl 3, M e C Na, C 3 I, C C sf, C B r, D M F n -B u 4 NS 4, T F C h, t.a (83 %) 12h, t.a. 5 (70 %) (+ )-(Ip c) 2 B, T F 30 % 2 2, 3% (aq) Na, -25º C, 1 2h C 3 C 2 C P Cl 3, E t 3 N, tosil at d e coli na C 3 C 2 48 h, t.a. (80% ) 6 1 C P - (60 %) N + M e 3 Esquema 1 La preparación del segundo de los potenciales inhibidores (compuesto 2), que se distingue del primero en la longitud de la cadena carbonatada de la posición 1 transcurrió de forma similar al caso anterior. Finalmente, en el esquema 2 se muestra la vía de síntesis que hemos desarrollado para la preparación del potencial inhibidor 3, que incorpora un grupo acetamido en la posición 2. 2 N CC 3 Cl Ph N Et N C C 3 LiAl 4 C 2 Cl 2, NEt 3, 50ºC,20h TF, (-50ºC) C 2 20 min 7 8 (65%) 9 N (89%) C 2 C 3 (C 2 ) 17 S 2 C 3, Na, TF, 72h, 80ºC C C N 2 (C 2 ) 17 C S 4, (8N) 2 N K 2 C 3, 100ºC, 24h 10 (93%) 11 (85%) C 3 Cl DMAP, CCl 3, 48h, t.a C 3 12 N (79%) C P Cl Et 3 N, benzè t.a. C 3 N 13 C P Me 3 N, MeCN C Tub tancat, 48h, 65 ºC 30% a partir de 12 C 3 N 3 P - N + Me 3 Esquema 2 6

7 6. Valoración de la actividad inhibidora de los análogos obtenidos por síntesis. Con los compuestos finales 1, 2, 3 y el intermediario 11 (inhibidor 4) obtenidos, se ha procedido a determinar su efecto inhibidor sobre dos de las enzimas diana del proceso de síntesis de PAF. Estas enzimas han sido, por una parte, la PLA2, obtenida comercialmente en estado puro, y por otra, la lisopaf acetiltransferasa (lisopaf-at), enzima no comercial que tuvo que obtenerse por ensayo en extractos celulares de Caco-2. La evaluación se ha realizado atendiendo a dos criterios, la concentración inhibidora 50 (IC 50 ) que ha sido aplicada a todos los inhibidores frente a ambas enzimas, y la constante de inhibición (Ki) estimada por la representación de Dixon, que ha sido aplicada a todos los inhibidores sobre la enzima pura PLA2. Los inhibidores 1 y 2 que se distinguen sólo en la longitud de la cadena de ácido graso en posición 1 (C16 o C18) han facilitado unos resultados muy similares cuando se comparan sobre la misma enzima. La IC 50 de estos dos compuestos era de 1 mm frente a la PLA2 y de 25 µm frente a la actividad lisopaf-at. Respecto al inhibidor 3, la modificación introducida en posición 2 parece mejorar su capacidad inhibidora, ya que sobre la actividad PLA2, la IC 50 es de 2 µm (del orden de 500 veces inferior a la de los inhibidores 1 y 2). La IC 50 sobre la actividad lisopaf-at fue de 7,5 µm. El inhibidor 4 presentaba capacidad inhibidora irrelevante. Los valores de Ki de los inhibidores 1 y 2 sobre la actividad PLA2 fue de 0,25 mm, del inhibidor 3 de 0,03 mm, y del inhibidor 4 de 0,75 mm. Tales valores validan como compuesto de interés diferenciador al inhibidor 3, que puede ser considerado para futuros estudios de aplicación farmacológica y eventualmente terapéutica. 7

8 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Los resultados presentados en el presente proyecto muestran por primera vez que las células epiteliales del intestino humano diferenciadas son capaces de sintetizar el proinflamatorio PAF en respuesta a la infección por bacterias enteropatógenas (Escherichia coli 157:7) o enteroinvasivas (Salmonella enteritidis). emos podido asignar la responsabilidad de este incremento de PAF intestinal a la estimulación de la fosfolipasa A2 que genera el precursor lisopaf en un mecanismo dependiente de calcio. Estos resultados se han podido confirmar por experimentos, tanto en células de carcinoma de colon humano en cultivo y diferenciadas, como por experimentos con tejido epitelial entero de colon humano. Estos datos confirman nuestra hipótesis y abren la puerta a posibles dianas terapéuticas para combatir la inflamación intestinal por infección u otras etiologías. En relación con esta línea de investigación nos habíamos propuesto en el proyecto el poder establecer una correlación entre los niveles de PAF intestinal y las enfermedades inflamatorias intestinales. En tal caso, se podría contemplar el control de los niveles de PAF como herramienta de un cierto valor terapéutico. El número de biopsias obtenidas por colonoscopia han permitido establecer una media del valor del nivel de PAF en el colon humano, y distinguir los niveles de PAF en el colon de enfermos de Crohn, que resulta ser apreciablemente menor, o los niveles de los enfermos de colitis ulcerosa, que resulta ser claramente superior. Dificultades en la obtención de las biopsias, que siempre deben contar con el consentimiento del paciente, no han permitido obtener un estudio estadísticamente significativo en cuanto a los valores correspondientes a estas dos patologías. Los datos son coherentes y 8

9 sugerentes, no descartándose ninguna posibilidad de interés terapéutico. El estudio se ha completado con la síntesis de cuatro análogos del PAF y su ensayo como posibles inhibidores de enzimas involucradas en la síntesis de PAF. La potencia inhibidora sobre PLA2 y lisopaf acetiltransferasa del compuesto 3 a concentraciones del orden de micromolar lo convierten en buen candidato para el desarrollo de posibles moduladores de la síntesis de PAF en los que la industria farmacéutica podría estar interesada. 4. Publicaciones Egea, L.; Giménez, R.; Badia, J.; Baldomà, L.; Aguilar, J. (2004). The pro- inflammatory agent PAF and the response to bacterial infection of Caco-2 epithelial cells. Proceedings of the workshop: rigin and evolution of human pathogens, Universidad Internacional de Andalucía y Instituto de Salud Carlos III. Egea, L.; Giménez, R.; Lúcia, D.; Modolell, I.; Badia, J.; Baldomà, L.; Aguilar, J. (2008). Increased production of the ether-lipid platelet-activating factor in intestinal epithelial cells infected by Salmonella enteritidis. BBA- Molecular and cell biology of lipids (en proceso de revisión). 9