Microscopia. Microscopios ópticos. microscopio compuesto: Mejoró significativamente la calidad de imagen del microscopio simple

Transcripción

1 Microscopios ópticos microscopio simple: Con él se describieron por 1º vez las bacterias microscopio compuesto: Mejoró significativamente la calidad de imagen del microscopio simple

2 Microscopios ópticos Vet. Sergio Abate, Dr. Mag. Profesor Adjunto Microbiología Sede Atlántica UNRN

3 Microscopio ópticos invertido Vet. Sergio Abate, Dr. Mag. Profesor Adjunto Microbiología Sede Atlántica UNRN

4 Microscopio óptico invertido Vet. Sergio Abate, Dr. Mag. Profesor Adjunto Microbiología Sede Atlántica UNRN

5 J H I G Microscopios ópticos A)Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y amplía la imagen formada en los objetivos. B)Objetivo: lente situada en el revolver. Amplía la imagen, es un elemento vital que permite ver a través de los oculares. C)Porta objetos: elemento transparente (vidrio) que sostiene el objeto a observar, y permitiendo que los haces de luz lo atraviesen par a constituir la imagen. D)Lentes de la iluminación (condensador): lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. E)Sujeción del portaobjeto (platina): Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparación de adelante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa. Puede estar fija o unida al brazo por una cremallera para permitir el enfoque. F)Fuente de luz: Originalmente espejos, actualmente lámparas LED, guían la luz hacia el objeto G) Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador. H) Tubo: es la cámara oscura que porta el ocular y los objetivos. Puede estar unida al brazo mediante una cremallera para permitir el enfoque. I) Revólver: Es el sistema que porta los objetivos de diferentes aumentos, y que rota para poder utilizar uno u otro, alineándolos con el ocular. J)Tornillos macro y micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina o el tubo hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico permite desplazamientos amplios para un enfoque inicial y el micrométrico desplazamientos muy cortos, para el enfoque más preciso. Pueden llevar incorporado un mando de bloqueo que fija la platina o el tubo a una determinada altura.

6 Microscopios ópticos Características de la microscopía óptica con microscopios compuestos: Se utiliza para estudiar objetos delgados, (cuanto mayor aumento se desea obtener, mas delgada debe ser la muestra para obtener una imagen correcta), ya que la profundidad de campo del microscopio óptico es muy limitada. Generalmente se usan para observar extendidos finos o cortes de tejidos realizados con equipos de corte muy delgado (micrótomos). La imagen formada depende de la luz que atraviese la muestra, y usualmente son necesarias técnicas especiales para aumentar el contraste de la imagen: con bajos aumentos (objetivo de 40X) se suelen realizar observaciones directas en fresco (*), pero con máximos aumentos (objetivos de 100 X) se requieren técnicas de tinciones y usualmente preparados en seco o fijados (**) Las observaciones en fresco adquieren mayor definición en microscopios de luz común pero con dispositivos especiales que permiten aplicar las técnicas de campo oscuro o contraste de fases (*): observación en fresco: se observa un objeto en las mismas condiciones en que el objeto se presenta naturalmente, pudiendo agregar agua para facilitar la dispersión de las partes del material (**) Preparados en seco o fijados: antes de observar, el objeto es «fijado» con calor y/o fijadores químicos, con el objeto de evitar ser barridos en los procesos de tinción a los que será sometido antes de ser observado el material

7 Microscopios ópticos Características de la microscopía óptica con microscopios compuestos: La imagen vista bajo un microscopio convencional, (microscopio óptico de campo claro = MOCC) es formada por el objetivo del microscopio, y finalmente se observa en el ocular que es donde la imagen se amplía. Si la muestra no absorbe la luz, no habrá esencialmente contraste entre los objetos que constituyen la muestra y el espacio vacío entre dichos objetos, y no podremos observar la imagen (veremos un campo microscópico iluminado sin objetos dentro). Por ejemplo, la mayoría de las células vivas absorben poca luz (a excepción de las células rojas de la sangre y los cloroplastos) y por lo tanto, son difíciles de visualizar a través de un MOCC. Mucho menos luz absorben diferentes estructuras de los microorganismos, esencialmente mas pequeños que una célula eucariota. Para solucionar esta limitación es que se utilizan los colorantes, técnicas que «engrosan» las estructuras, o microscopio de campo oscuro ó contraste de fases. Preparado sin colorear Preparado coloreado

8 Microscopios ópticos Límite de resolución óptica de un microscopio óptico compuesto: El límite de resolución óptica (la menor distancia entre 2 puntos que permite a un microscopio óptico identificar a dichos puntos como entes independientes) depende de un fenómeno físico óptico llamado difracción. En la determinación de la difracción participan varios factores: 1º) la apertura numérica (AN) del sistema 2º) la longitud de onda de la luz empleada 3º) aberraciones ópticas dependientes de la calidad de los lentes Suponiendo que las aberraciones ópticas fueran despreciables, que se utiliza luz de lámpara o luz solar mediante espejo (luz verde de 550 nm), la AN del aire (0,95) o la generada por uso de aceite (1,5), basándose en la siguiente fórmula podemos deducir que el limite de resolución con el mejor microscopio óptico es de aprox. 0,2 micras. 550 nm/2*0,95= 289 nm = 0,289 µ 550 nm/2*1,5= 183 nm = 0,183 µ

9 Microscopios ópticos: contraste de fases El microscopio de contraste de fases permite observar preparados en fresco (células, y algunas de sus estructuras especializadas) con mayor definición que un MOCC, sin necesidad de fijar y teñir, por lo que resulta especialmente útil para células vivas. Se basa en el aprovechamiento de pequeñas diferencias entre los índices de refracción de distintas partes de una muestra: la luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Utiliza una serie de anillos ópticos (uno a nivel del objetivo y otro a nivel del condensador), que permiten anular la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas de la muestra; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas.

10 Microscopios ópticos: contraste de fases El microscopio de contraste de fases, ilumina a la muestra mediante un cono de luz hueco (luz en la periferia y oscuridad en el centro), de manera similar a lo que ocurre con el microscopio en campo oscuro. Sin embargo, en el microscopio de contraste de fases el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo, el cual contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción del objeto observado en una muestra transparente, haciéndolo visible Por qué razón?

11 Microscopios ópticos: contraste de fases Aunque las células absorben poca luz, tienen diversos espesores y diversos índices de refracción en sus partes, lo que conduce a las diferencias de fase de las ondas de luz que pasan a través de ellas. La fase de un haz de luz es inobservable a la vista (apenas se ve la intensidad, no la fase). Cryptosporidium spp El diseñador del método de contraste de fase, Zernike (por lo cual obtuvo un premio Nobel de física) calculó la manera de hacer que las diferencias de fase se observaran en la imagen como si se tratara de diferencias de intensidad, logrando así visualizar detalles que no eran posibles apreciar en un microscopio convencional.

12 Microscopios ópticos: contraste de fases Células eucariotas en cultivos in vitro: la misma muestra, con MOCC (microscopia óptica de campo claro) y MOCF (microscopía óptica de contraste fe fase)

13 Microscopios ópticos: contraste de fases Basidiosporas: Estudios de factores de virulencia en infección de plantas por Ustilago maydis Hernandes: INCI v.28 n.5 Caracas mayo 2003 Semen: Estudios de calidad espermática previo uso para inseminación.

14 Microscopio óptico de campo oscuro Vet. Sergio Abate, Dr. Mag. Profesor Adjunto Microbiología Sede Atlántica UNRN

15 Microscopios ópticos de fluorescencia Vet. Sergio Abate, Dr. Mag. Profesor Adjunto Microbiología Sede Atlántica UNRN

16 Microscopios ópticos de fluorescencia Andrología: estudio de integridad de ADN en espermatozoides con naranja de acridina Fitopatologia: Ustilago maydis como fitopatógeno, tinción fluorescente de lectina con Alexa-fluor-488

17 Microscopios ópticos de fluorescencia Observación con tinciones convencionales Observación con inmunofluorescencia directa

18 Microscopía confocal Un microscopio confocal es un microscopio capaz de obtener imágenes tridimensionales de una célula. Se basa en un principio similar al de un microscopio de fluorescencia: Para observar preparaciones con este microscopio es necesario teñirlas con sustancias fluorescentes o marcarlas con sustancias (como los antoicuerpos) previamente conjugadas con fluorocromos. Pero, las siguientes diferencias hacen de la microscopía confocal una técnica que permite revelar estructuras y funcionamientos celulares con mayor detalle y de manera dinámica: Se utilizan dos diafragmas confocales (uno antes de la muestra y otro después) capaces de enfocar la iluminación en un único punto de la muestra. Se utiliza un láser como fuente luminosa, y con él se va barriendo la muestra por todo su volumen, plano a plano, creando muchas imágenes bidimensionales simultáneas En vez de ser el ojo del operador el que captura las múltiples imágenes, éstas son capturadas y analizadas por un ordenador, generando finalmente una imagen tridimensional del objeto. Las imágenes son observadas mediante un monitor o fotográficamente.

19 Microscopía confocal Vet. Sergio Abate, Dr. Mag. Profesor Adjunto Microbiología Sede Atlántica UNRN

20 Microscopía confocal

21 Microscopía confocal Colonización de un pelo de raíz de Poaceae (gramíneas) por Azospirillum spp

22 Microscopía confocal Gfp-tagged bacteria (arrow heads) were visualized in the cortex (a) near the endodermis barrier (b), passing this barrier (c) and colonizing xylem vessels (d e). Other fluorescent microorganisms were visualized inside xylem vessels of inoculated cuttings (arrows in f) as well as of nontreated plants (arrows in g).

23 Microscopía confocal (a) Interaction between the wild-type strain Pseudomonas chlororaphis PCL1606 cells (in red) concentring around and colonizing R. necatrix hyphae (in green). Disturbance of hyphal growth can be observed as changes in directionality, increase in the hyphal size and in the number of vacuoles. (c) R. necatrix hyphal network in the rhizosphere of avocado roots not bacterized. The white asterisks in picture a correspond to the colonies aggregates of the wild-type strain P. chlororaphispcl1606 in close contact with the R. necatrixch53-gfp hyphae.

24 Microscopios electrónicos: barrido

25 Microscopios electrónicos: barrido

26 Microscopios electrónicos: transmisión

27 Microscopios comparación

28 Vet. Sergio Abate, Dr. Mag. Profesor Adjunto Microbiología Sede Atlántica UNRN

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