ABREVIATURAS... XI I. INTRODUCCIÓN EL TOMATE... 3

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1 ÍNDICE ABREVIATURAS... XI I. INTRODUCCIÓN EL TOMATE Taxonomía Características generales La flor Características del fruto CUAJADO Y DESARROLLO DEL FRUTO Regulación hormonal durante el cuajado del fruto Genes de identidad floral relacionados con el cuajado del fruto Partenocarpia REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN PLANTAS Factores de Transcripción tipo DOF EL TOMATE COMO SISTEMA EXPERIMENTAL PARA ESTUDIOS DE DESARROLLO II. OBJETIVOS III. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL VEGETAL Y SU MANIPULACIÓN Material vegetal Condiciones de cultivo TRATAMIENTOS PROCESAMIENTO DE MATERIAL VEGETAL PARA MICROSCOPÍA Fijación de tejido vegetal Inclusión de tejido vegetal en resina y tinción con toluidina Inclusión de tejido vegetal en parafina Clareado de tejidos MICROSCOPÍA Microscopía estereoscópica Microscopía óptica Microscopía confocal Criomicroscopía electrónica de barrido MICROORGANISMOS Bacterias... 31

2 4.2 Medio de cultivo para bacterias Transformación de cepas bacterianas PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Extracción de DNA plasmídico Extracción de DNA genómico Extracción de RNA total AMPLIFICACIÓN DE DNA POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ELECTROFORESIS DE DNA EN GELES DE AGAROSA Y PURIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA34 8 DIGESTIÓN DE DNA CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN TÉCNICAS DE CLONACIÓN Plásmidos utilizados Ligación de fragmentos mediante la técnica de recombinación homóloga Gateway (Invitrogen TM ) Secuenciación ANALISIS DE SECUENCIAS Árbol filogenético ESTUDIOS DE EXPRESIÓN RT-PCR cuantitativa a tiempo real (qrt-pcr) Hibridación in situ ANALISIS Southern blot Digestión, electroforesis y transferencia del DNA a membrana Generación de la sonda marcada con dioxigenina Prehibridación, hibridación y lavados Revelado INMUNOLOCALIZACIÓN DE AUXINAS Procesamiento de las muestras Inmunodetección colorimétrica ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD GUS ENSAYO DE EXPRESIÓN TRANSITORIA EN HOJAS DE Nicotiana benthamiana ENSAYO DE SILENCIAMIENTO MEDIADO POR VIRUS TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS DE TOMATE... 44

3 17.1 Esterilización y germinación de semillas Cultivo de explantes primarios Preparación de Agrobacterium tumefaciens para la transformación Cocultivo y lavado de explantes Inducción de organogénesis Aclimatación de plantas en invernadero Soluciones y medios de cultivo utilizados EVALUACIÓN DEL NIVEL DE PLOIDÍA TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS DE ARABIDOPSIS Selección de transformantes EVALUACIÓN DE CARACTERES FENOTÍPICOS DEL DESARROLLO DE PLANTAS DE TOMATE Análisis de viabilidad y germinación de los granos de polen de tomate Características del fruto en plantas de tomate Contenido de sólidos solubles Acidez titulable Índice de madurez e índice de sabor CUANTIFICACIÓN DE HORMONAS ANÁLISIS ESTADISTICO MAPEO POSICIONAL DE LA MUTACIÓN HYDRA Generación de la población recombinante Mapeo cromosómico Detección de polimorfismos mediante el análisis de curvas de fusión de alta resolución 53 IV. CAPITULO I: CARACTERIZACIÓN DEL MUTANTE hydra DE TOMATE RESULTADOS CARACTERIZACIÓN DE MUTANTES ANDROESTÉRILES Y PARTENOCÁRPICOS DE TOMATE Identificación de líneas mutantes Análisis de complementación Caracterización fenotípica del mutante hydra BASES MOLECULARES DEL DESARROLLO REPRODUCTIVO DE PLANTAS hydra Control hormonal MAPEO GENÉTICO DEL LOCUS HYDRA Localización cromosómica... 85

4 3.2 Mapeo fino del locus HYDRA DISCUSIÓN CAPÍTULO I La mutación hydra causa malformaciones en la flor asociadas a la formación de frutos partenocarpicos Base hormonal del fenotipo mutante hydra La mutación hydra representa una nueva fuente de partenocarpia Interés biotecnológico de la mutación hydra V. CAPITULO II: CARACTERIZACIÓN DEL GEN SlDOF10 Y DE SU PAPEL EN EL CUAJADO DEL FRUTO EN TOMATE ANTECEDENTES RESULTADOS CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL UNIGEN SGN-U (SlDOF10) Análisis in silico Localización subcelular de la proteína SlDOF Silenciamiento transitorio de los genes SlDOF10 y SlDOF Análisis de expresión de los genes SlDOF10 y SlDOF Localización del transcrito de los genes SlDOF10 y SlDOF Análisis del patrón de expresión del gen SlDOF10 mediante la línea reportera psldof10:gus Actividad del promotor psldof10 en el sistema heterólogo Arabidopsis thaliana Detección de secuencias consenso de elementos reguladores en cis presentes en la región promotora del gen SlDOF ANÁLISIS FUNCIONAL DEL GEN SlDOF Caracterización de plantas transgénicas DISCUSIÓN CAPÍTULO II El gen SlDOF10 codifica un factor de transcripción de tipo Zinc Finger, perteneciente a una familia de proteínas específica de plantas El gen SlDOF10 y su parálogo SlDOF31 no tienen funciones redundantes Regulación de la expresión del gen SlDOF Regulación hormonal del gen SlDOF El gen SlDOF10 participa en el desarrollo vascular de la planta Implicación del gen SlDOF10 en el cuajado del fruto

5 VI. CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFÍA VIII. ANEXOS