Desarrollo de nuevas líneas celulares permisivas a PRRSV, y sus implicaciones próximas. Paloma Suárez, DVM, Ph.D New Products Marketing Madison, NJ

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Alfonso San Martín Cruz
hace 7 años
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1 Desarrollo de nuevas líneas celulares permisivas a PRRSV, y sus implicaciones próximas Paloma Suárez, DVM, Ph.D New Products Marketing Madison, NJ 1

2 Introducción Primera descripción de la enfermedad a finales de los 80 (USA) y principios de los 90 (Europa) Enfermedad misteriosa del cerdo. Posteriormente se descubrió su etiología vírica y se denominó Síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) Probablemente una de las enfermedades más devastadoras del sector porcino. En un estudio reciente realizado en los EE.UU los costes asociados a PRRS en ese país, se han estimado en 530,6 millones de dólares*, o lo que es lo mismo, entre 5,6 y 7,6 dólares por cada cerdo que se envía al rastro * Johnson, C et al The impact of PRRS on the cost of Pig production. National Pork Board. 2

3 Introducción Virus por primera vez aislado en 1991 (Europa Lelystad Virus) y 1992 (USA VR-2332) El aislamiento se realizó, inicialmente, en Macrófagos Alveolares Porcinos (MAPs), ya que no era posible crecerlo en líneas celulares establecidas Necesidad de sacrificar lechones (los macrófagos no se multiplican) No uniformidad en el número de células obtenidas; diferencias en títulos víricos Contaminaciones frecuentes (flora del cerdo) Animales libres de la enfermedad Uso en la producción comercial de vacunas limitado (caro y difícil). Sólo vacunas muertas. 3

4 Macrófagos Alveolares Porcinos Fuente; Cinta Prieto, Universidad de Madrid 4

5 En 1992, aparece la primera línea celular que permitía crecer el virus 5

6 MARC-145 Fuente; Cinta Prieto, Universidad de Madrid 6

7 Características Obtenida a partir de un clon susceptible de la línea MA-104, una línea celular de riñón de mono verde africano. Posteriormente se produjeron nuevos clones a partir de misma línea celular dando origen a la línea MARC-145 En la actualidad, el crecimiento del virus PRRS en células de simio, está protegido por patente en algunos países. Permitido para uso en investigación Use restringido para la producción de vacunas 7

8 Por qué Pfizer investiga en PRRS? Pfizer es una compañía líder en CRP PRRS es una enfermedad muy interesante para nuestro departamento de investigación y desarrollo Distribución mundial de la enfermedad (aunque dos tipos muy diferenciados) Múltiples retos; enorme variabilidad genética y antigénica Con incremento en virulencia en varias regiones Elevado impacto económico 8

9 Por qué Pfizer investiga en PRRS? Grupo de investigación en PRRS con más de 20 años de experiencia propia y/o con colaboraciones Avances generados en el conocimiento genético del virus y de sus proteínas estructurales Primer clon infeccioso de ADN complementario de un virus PRRSV tipo 2 Primer uso del virus PRRSV como vector Descubrimiento del receptor CD163 de PRRS 9

10 PRRSV y Pfizer 10

11 Qué es el receptor CD163? El CD163 es una glicoproteína de membrana específica que se expresa en la superficie de los macrófagos CD163 está involucrado en el reconocimiento de varios ligandos y patógenos como el virus de la Fiebre Porcina Africana. En el año 2007 nuestros científicos descubrieron que un receptor, denominado CD163, estaba involucrado en la penetración del PRRSV en las células Anticuerpos monoclonales frente al CD163 bloqueaban la entrada del virus Transfección de células con el cdna del receptor, conferían susceptibilidad 11

12 El CD163 hace que las células sean permisivas Se realizaron librerías de cadn a partir de Macrófagos Alveolares que se seleccionaron por su habilidad de hacer que células no de simio fueran susceptibles al PRRSV. Se identificó el CD163 como el receptor primario frente al virus. La transfección transitoria del cdna fue necesaria y suficiente para hacer que diferentes líneas celulares fueran permisivas a PRRSV. Posteriormente hemos creado líneas celulares que de modo continuo expresan el receptor CD163 en su superficie, permitiendo la replicación del virus. Dichas líneas proceden de diferentes especies, BHK21 (riñón de hamster), PK0809 (riñón porcino), y NLFK (riñón felino). 12

13 Implicaciones Futuras Evidentemente, la más cercana es la generación de nuevas vacunas 13

14 Vacunación frente a PRRSV hoy Existen tanto vacunas vivas como muertas Ampliamente usadas, junto con otras estrategias Vacunación en primerizas Vacunación en cerdas Vacunación en lechones Han sido útiles, pero todavía no han controlado totalmente el problema* *Yoo, D Development of stable cell lines permissive for PRRSV replication and production. National Pork Board. Research Report. NPB

15 Desafíos presentes en PRRSV Alta tasa de mutación y variación genética La inmunidad natural es limitada frente a cepas heterólogas Mecanismos de evasión del sistema inmune - El virus induce la producción temprana de Interleukina 10 una citoquina antiinflamatoria muy potente - La producción de Interferón-α está suprimida en algunas cepas del virus - Producción tardía de interferón-γ - Producción tardía de anticuerpos neutralizantes 15

16 Diferente línea celular: diferentes propiedades La atenuación es un proceso evolutivo El virus acumula mutaciones que le permiten crecer de forma eficiente en la línea celular Al mismo tiempo pierde propiedades que son útiles para su multiplicación en el cerdo Las presiones selectivas son diferentes dependiendo de la línea celular utilizada y, por ello, los virus vivos atenuados en diferentes líneas celulares tienen propiedades diferentes 16

17 Desarrollo actual Estas líneas celulares permitirán el desarrollo de nuevas vacunas, tanto muertas como vivas modificadas frente a PRRS y potencialmente con nuevas propiedades De hecho, ya hemos obtenido el virus tipo 2 Master para el desarrollo de una vacuna (ya disponible en US) mediante el pase en células no de simio como de riñón porcino, CD163+ PK y células de riñón de hamster, CD163+ BHK que expresan el receptor CD163 Clonaje molecular (clon de ADN complementario infectivo) MAPs Células PK-CD163 Células PK-CD163 Células BHK-CD163 Virus Master 17

18 Desarrollo actual A pesar de su paso en células BHK el virus de la vacuna de Pfizer replica bien in vitro en MAPs y sus predecesores perdieron genes que inhiben la liberación de ciertos interferones por las células del hospedador 18

19 Nuevas oportunidades en el futuro El tener un clon infectivo de ADN complementario y una línea susceptible permitirá en un futuro el alterar el genoma del PRRSV y por lo tanto: Identificar factores de virulencia y construir virus genéticamente atenuados El desarrollo de Vacunas DIVA Utilizar el virus del PRRS como vector adicionando genes que confieran protección frente a otras enfermedades del cerdo 19

20 Muchas gracias por su atención 20

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