Análisis Inmunofenotípico de los SLPc.
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- Marcos Olivares Cruz
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1 Análisis Inmunofenotípico de los SLPc. Aula Formativa Hematólogos Jóvenes, 24 de marzo 2011 Eugenia Fernández Mellid Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela
2 Introducción La citometría de flujo (CMF) estudia la presencia/ausencia de antígenos específicos (inmunofenotipo) en una población a estudio. Para seleccionar los marcadores inmunofenotípicos (panel) que empleamos para estudiar una muestra nos basaremos en: Historia clínica. Hallazgos clínicos, analíticos y pruebas de imagen. Estudio morfológico. (Estudio CMF previo) Poblaciones celulares/linajes a identificar: Linfocitos T Linfocitos B Células plasmáticas Serie mielomonocítica
3 2006 Bethesda International Consensus Recommendations on the Inmunophenotypic Analysis of Hematolymphoid Neoplasia by Flow Cytometry: Optimal Reagents and Reporting for the Flow Cytometric Diagnosis of Hematopoietic Neoplasia. Cytometry B Clin Cytom. 2007;72 Suppl 1:S14-22.
4 Interpretación y análisis del estudio mediante CMF Análisis inmunofenotípico busca identificar: 1. Linaje celular 2. Estadio madurativo. 3. Presencia de poblaciones clonales 4. Análisis del fenotipo de la población a estudio.
5 Citometría de flujo en los SLPc Síndromes linfoproliferativos crónicos (SLPc): Proliferaciones de linfocitos maduros. Inmunofenotipo similar al de las células linfoides maduras normales (ausencia de marcadores antigénicos de inmadurez). Pueden ser: De células B De células T De células NK. Muestras a analizar: Sangre periférica Aspirado de médula ósea. Muestras de células obtenidas por PAAF/biopsia de ganglio, suspendidas en soluciones conservantes. Líquido ascítico, pleural, cefalorraquídeo.
6 Citometría de flujo en los SLPc IDENTIFICACIÓN DE POBLACIONES DE LINFOCITOS: Basado en 3 marcadores: CD19: Linfocitos B CD3: Linfocitos T CD56: Linfocitos NK. Empleando CD45: proporción de las distintas poblaciones sobre la celularidad total.
7 Dos fases: Diferenciación linfoide B: 1. Antígeno-independiente: tiene lugar en la médula ósea (adulto)linfocitos B inmunocompetentes y autotolerantes. 2. Antígeno-dependiente: migración de linfocitos B maduros desde la médula ósea a órganos linfoides secundarios.
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9 NEOPLASIAS DE LINFOCITOS MADUROS B Población B anormal puede distinguirse: Cadenas ligeras de superficie: Kappa o lambda. Ratio kappa/lambda <0,3 o > 4 Expresión aberrante de antígenos: Presencia de antígenos que no se expresan normalmente en células de línea B (antígenos de línea linfoide T ) Presencia de antígenos en una subpoblación de linfocitos B que se expresan normalmente en otras subpoblaciones pertenecientes a compartimentos biológicos/ganglionares distintos. (p.e Bcl2 en CD10+)
10 EXPRESIÓN ABERRANTE DE ANTÍGENOS: Expresión de CD5 y CD10: CD5: molécula accesoria implicada en la modulación de los procesos de activación y diferenciación, expresada en la superficie de los linfocitos T y en una subpoblación de linfocitos B. CD10: marcador de superficie de los precursores más inmaduros de linfocitos B En función de la expresión de CD5 y CD10 distinguimos: CD5+/CD10- CD5+/CD10+ CD5-/CD10- CD5-/CD10+
11 Típicamente CD20 +d CD22+d LLC-B Manto Otros CD23+ CD23- Algunos LNH-B de zona marginal Si CD 23 -/+d: ver CD200: CD5+/CD10- FMC7- CD200++: LLC-B CD200-/+d: Manto Expresión débil de Igs de superficie CD38 ZAP 70 CD20 +d/+ FMC7-/+d Linfoma linfoplasmocítico Linfoma B difuso de células grandes
12 LLC-B: ZAP-70 y CD38: valor pronóstico. ZAP-70: dificultades técnicas para una determinación fiable: Marcador citoplásmico EDTA, tiempo Positividades débiles CD-38: determinación más fiable, aunque: No clara positividad/negatividad Células positivas y negativas en la misma muestra. Diferencias según fluorocromo, SP o BM Variaciones en el curso de la enfermedad y tras tratamientos.
13 ZAP-70 CD200
14 CD5-/CD10+ Folicular Bcl-2 + CD43- Difuso de células grandes Bcl-2-/+d CD43+ Otros Burkitt en la infancia Algunas Tricoleucemias.
15 LNH-B difuso de células grandes: No-centro germinal Centro germinal: 20-40% Habitualmente CD10+ Importancia diagnóstica de morfología y molecular. Burkitt en la infancia: CD5-/CD10+ con elevada frecuencia Bcl-2,CD10++, CD43- Para diferenciar de LNHBCG tener en cuenta inmunofenotipo, morfología, índice de proliferación y molecular. Tricoleucemia: morfología y respuesta al tratamiento similar a las CD10-
16 Tricoleucemia Marginal Otros CD20++ CD22++ CD11c++ CD25+ CD103+ Kappa/lambda superficie+/++ CD5-/CD10- CD11c+/- CD103+/- Ocasionalmente Kappa/lambda superficie Kappa/lambda citoplásmica+ LNH-B difuso cels grandes Folicular CD10- Manto CD5-
17 Tricoleucemia
18 CD5+/CD10+: Neoplasias linfoides maduras B que expresen CD5 y CD10 son infrecuentes. Múltiples subtipos de LNH pueden presentar este fenotipo. Valorar: Morfología Tamaño celular (Folicular, Manto, LLC vs Burkitt, LDCG, LLA) Citogenética, FISH
19 Tipo Marginal Tricoleucemia LLC-B Manto Folicular LNHBCG Burkitt CD /- + CD5 -/(+) CD10 - +/- Variante CD d/ CD Igs Superf IgM IgM,IgG +d/ /(-) + CD /(+) - FMC /(-) +/- +/- -/(+) CD11c -/+ + CD25 -/+ + CD103 -/(+) + Variante +/- Variante+/- Variante / / /(+) - CD20 +/(-) (-) + CD79b Inmunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. M C Béné, T Nebe, P Bettelheim, B Buldini, H Bumbea, W Kern, F Lacombe, P Lemez, I Marinov, E Matutes, M Maynadié, U Oelschlagel, A Orfao, R Schabath, M Solenthaler, G Tschurtschenthaler, A M Vladareanu, G Zini, G C Faure and A Porwit Leukemia, (21 January 2011) doi: /leu
20 Citometría de flujo en los SLPc-T/NK Mayor dificultad para identificar poblaciones inmunofenotípicas anormales de células T o NK->clasificación peor establecida. Diagnóstico clínico+morfológico+inmunofenotípico+molecular. Desde el punto de vista de CMF, población T/NK puede diferenciarse por: Expresión débil/fuerte/pérdida de antígenos T/NK(CD3, CD5, CD7) Expresión aberrante de antígenos B. Alteración ratio CD4+/CD8+ Expresión TCR V-beta (preferible reordenamiento TCR por técnicas moleculares)
21 Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasm Fiona E. Craig and Kenneth A. Foon From by on April 14, 2009
22 Citometría de flujo en los SLPc PANEL DE SCREENING: Identificación de poblaciones linfocitarias: CD19, CD3, CD56 Panel B (población CD19+): CD5, CD20, CD22, CD23, CD103, CD10, Kappa- Lambda de superficie, CD25, CD79b, CD38. Panel T: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD7 Panel NK: CD56, CD57, CD45, CD158, CD94 Inmunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. M C Béné, T Nebe, P Bettelheim, B Buldini, H Bumbea, W Kern, F Lacombe, P Lemez, I Marinov, E Matutes, M Maynadié, U Oelschlagel, A Orfao, R Schabath, M Solenthaler, G Tschurtschenthaler, A M Vladareanu, G Zini, G C Faure and A Porwit Leukemia, (21 January 2011) doi: /leu
23 Figure 2 MARGINAL ZONE CD19, CD20, CD22, CD79, sig, FMC7, bcl-2, CD23+ (CD5, CD10, CD43, bcl-6 neg) NODAL MALT CLL CD19, CD20, CD43,CD23, sig+/-, CD5 (CD79 CD10, CD22, FMC7 neg) HCL CD19, CD20, CD22, sig++, CD11c, CD25, CD103, CD123 (CD5, CD10, CD23 neg) T LYMPHOMAS AND ANGIOIMMUNOBLASTIC CD5+/CD10+/CD3+/CD4+ SEZARY CD3, CD2, CD5, CD4, CD7+/-(CD8 neg) LARGE CELLS ANAPLASTIC CD2, CD4, CD3+, CD30 PERIPHERAL CD2, CD3, CD5, CD4 ANGIOCENTRIC CD2, CD5, CD4 ou CD8, CD56 INTESTINAL CD3, CD7, CD103 ATLL CD3, CD4, CD25, CD45RO, CD7neg MANTLE ZONE CD19, CD20, CD22, CD79, FMC7, sig, bcl-1, CD5, CD43, (CD10, CD23 neg) BURKITT CD19, CD20, CD22, CD79, sig, CD10, DR, bcl-6 (CD5, CD23, Tdt neg) FOLLICULAR CD19, CD20, CD22, sig+, CD79, CD10, bcl-2 (CD5, CD23, CD43 neg) INTESTINAL OR LUNG MALT Follicular, mantle zone, marginal zone SLVL circulating marginal zone cells DIFFUSE LARGE B CELL LYMPHOMAS, sig+, cig+, CD19, CD20, CD79, CD22++, CD79, CD10+ (CD5 rare cases, bcl-2, bcl-6, MUM-1 can be useful for further classification) WALDENSTROM CD19, CD20+, CD22, CD79 sig+, cig, FMC7 (CD5, CD10, CD23 neg) MYELOMA cig, CD56, CD45+, CD38, CD138 (CD19, CD20, CD22 neg)
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