DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS (HISTAMINA) Método HPLC ME

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1 Página 1 de 8 1. OBJETIVO Determinar histamina y otras aminas biógenas por HPLC con detector UV. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE El método es aplicable a los alimentos sospechosos de contener histaminas y otras aminas biógenas, principalmente productos hidrobiológicos frescos o procesados, harina de pescado, quesos y cecinas, recepcionados en la Sección Química de Alimentos. 3. FUNDAMENTO Extracción de aminas biógenas en ácido tricloroacético, derivatización precolumna mediante cloruro de dansilo y posterior análisis de los respectivos derivados dansilados por HPLC con detector UV. 4. DOCUMENTOS DE REFERENCIAS Norma Chilena NCh 2637.Of 2001 Productos hidrobiológicos Determinación de histamina y otras aminas biógenas - con detector UV. 5. TERMINOLOGÍA 5.1 Aminas biógenas: compuestos alergénicos generados por la degradación de aminoácidos que están contenidos en pescados y otros alimentos como derivados lácteos, cecinas, hígado de vacuno y ave, cacao, vinos y cerveza, los que al ser consumidos pueden causar reacciones alérgicas o cuadros de intoxicación. 5.2 HPLC : Cromatografía líquida de alta resolución 6. REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 REACTIVOS Acetona p.a Solución de bicarbonato de sodio 0.25 M (PM=84) Cloruro de dansilo 10 mg/ml. Solución de ácido tricloroacético (TCA) al 5% con estándar interno de efedrina 250 ppm Fase móvil: metanol HPLC y agua desionizada y filtrada (se usa gradiente).

2 Página 2 de Estándares: Aminas biógenas: Putrecina Cadaverina Tiramina Histamina Espermidina 6.2 INSUMOS Tubos de centrífuga con tapa rosca de 50 ml Papel filtro Whatman N 1, 4 o equivalente Filtros de membrana de 0.22 m Viales con tapa de 2 a 3 ml Columna C-18 fase reversa, (5 m) o equivalente 6.3 EQUIPOS Equipo HPLC con detector UV de longitud de onda variable Balanza analítica g Balanza de precisión 0.01 g Agitador mecánico de tubos Baño termorregulado a 60 C Centrífuga 2000 a 3000 rpm Micropipetas de L 7. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado en punto materiales, insumos y reactivos esté disponible. A continuación se describe el método analítico, es crucial si no se dispone de práctica con el método leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar. Es necesario utilizar guantes para este trabajo analítico como medida de bioseguridad.

3 Página 3 de MUESTREO / MUESTRA Chequear que antecedentes de la muestra en guía de ingreso coincidan con los rotulados en la muestra Una vez recibida la muestra en el laboratorio se debe realizar el análisis lo más pronto posible. En caso de ser necesario postergar el análisis, ésta se debe mantener a 18 C si la muestra proviene de producto congelado; entre 0 C y 4 C si la muestra corresponde a un producto fresco refrigerado, no debiendo superar más de 36 h en esta condición y a temperatura ambiente si la muestra corresponde a pescado seco, harina de pescado u otro producto con baja humedad Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo permite, almacenar aproximadamente 20 g de muestra como contramuestra y eliminar lo restante en bolsa de eliminación de desechos de laboratorio (Bolsa roja y/o amarilla). Anotar fecha de eliminación de la muestra en los antecedentes de la misma en Registro Registro de ingreso de muestras al Laboratorio de 7.2 PREPARACIÓN DE REACTIVOS Solución de bicarbonato de sodio 0.25 M (PM=84). Pesar 5.25 g de NaHCO 3 y llevar a un matraz de 250 ml, aforando con agua desionizada filtrada Cloruro de dansilo 10 mg/ml. Pesar 50 mg de cloruro de dansilo y llevar a un matraz de 5 ml aforando con acetona p.a. Guardar refrigerado en envase ámbar bien cerrado Solución de ácido tricloroacético (TCA) al 5% con estándar interno de efedrina 250 ppm. Pesar 25 g de TCA en un matraz aforado de 500 ml, agregar g de efedrina p.a. y aforar con agua para análisis Estándares: Aminas biógenas: Putrecina Cadaverina Tiramina Histamina Espermidina Preparar una solución patrón de 1000 mg/l de cada una de las aminas biógenas: Pesar 50 mg de cada una y aforar a 50 ml con solución de TCA 5% con estándar interno.

4 Página 4 de PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN Preparar a partir de las soluciones patrones, una mezcla que contenga al menos 3 niveles desde 50 a 500 µg/ml para la curva de calibración. Aforar cada vez con TCA 5% con estándar interno. 7.4 PREPARACIÓN DE CONTROLES Preparar un fortificado al límite de cuantificación del método. 7.5 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA O ETAPAS PREVIAS A REALIZAR LA MEDICIÓN Conservas: Si el líquido de cobertura es comestible, se recomienda homogeneizar todo el contenido del envase de lo contrario drenar el producto y homogeneizar en procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s Congelados: Descongelar dejando a temperatura ambiente por un máximo de 4 h y drenar Productos pesqueros salados: Preparar una solución saturada de cloruro de sodio y sumergir en ella el producto en salazón algunos segundos para retirar la sal superficial. Sacar la muestra de la solución y secar con papel absorbente, eliminar las espinas, trozar y preparar el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s Productos seco-salados, apanados, ahumados, quesos y derivados cárnicos: Preparar el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s Pescado fresco: limpiar, descamar, eviscerar y preparar el homogeneizado durante 60 s como se indica a continuación: a) Pescados de tamaño pequeño ( 15 cm): en su totalidad. b) Pescados de tamaño mediano: Sacar y descartar cabeza, cola, aletas y espinas; cortar en filetes para obtener toda la carne y piel. c) Pescados de tamaño grande: De cada uno de más de tres pescados cortar tres rebanadas en sentido transversal de 2.5 cm cada una, detrás de la aleta pectoral, en el medio y después de la abertura anal. Eliminar las espinas Mariscos frescos refrigerados y/o vivos: lavar, drenar y desconchar Homogeneizar la muestra en procesadora de alimentos de alta velocidad por un minuto.

5 Página 5 de Pesar 5 g en un tubo de centrífuga de 50 ml y agregar exactamente 10 ml de TCA 5% con estándar interno y tapar Agitar por 30 min en agitador mecánico Centrifugar a rpm por 15 min Filtrar el sobrenadante a través de un embudo con papel filtro Filtrar el extracto a través de filtro 0.22 m Realizar reacción de dansilación de la siguiente manera: En un vial de vidrio con tapa adicionar consecutivamente: 100 L de extracto o soluciones estándares 400 L de bicarbonato de sodio 0.25 M (ph 8 a 9) 200 L de solución de cloruro de dansilo 300 L de acetona p.a Cerrar herméticamente el vial e incubar a 60 C en baño termorregulado por 1 hora Enfriar a temperatura ambiente Inyectar 20 L de la muestra en HPLC Utilizar como blanco solución de TCA 5% con estándar interno y dansilar de igual forma que los estándares y las muestras 7.6 ANÁLISIS DE LA MUESTRA O REALIZACIÓN DE LA MEDICIÓN. CONDICIONES INSTRUMENTALES CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS Flujo de la fase móvil: 1 ml/min Longitud de onda: 254 nm Volumen de inyección: 20 µl Temperatura del horno de columna: 25 C Programa de gradiente de fase móvil Tiempo (min) Metanol (%) Agua (%)

6 Página 6 de Estabilizar por 15 minutos Todas las soluciones deben sonicarse si el equipo HPLC no cuenta con desgasificador on line Limpiar la jeringa y el inyector con agua después de cada inyección Al final del trabajo lavar la columna con: 70% metanol y 30% agua por 15 a 30 min Los tiempos de retención aproximados son: Amina biógena Efedrina 4 a 6 Putrecina 6 a 7 Cadaverina 7 a 9 Histamina 12 a 14 Tiramina 19 a 21 Espermidina 22 a 25 Tiempo de retención (min) 7.7 CÁLCULO DE RESULTADOS Calcular el nivel de histamina en µg/ml entregado por el HPLC utilizando estándar interno usando la siguiente fórmula: Cm = {(Am/Asi)-b} / m Cm Am m b Asi = Concentración de la amina biógena en el HPLC µg/ml = Área de la amina biógena de la muestra = Pendiente de la curva de calibración = Intercepto de curva de calibración = Área del estándar interno

7 Página 7 de La concentración total de aminas biógenas se realiza sumando las concentraciones de cada amina biógena Para determinar la concentración de cada amina biógena en la muestra, usar la siguiente fórmula: C = Cm x 10 g Donde: C = concentración de amina biogénica en mg/kg, de la muestra Cm = concentración de amina biogénica de la muestra en µg/ml obtenida de la curva de calibración g = peso de la muestra en gramos 7.8 ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DEL ENSAYO Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos realizados con el método de ensayo recogido en este procedimiento. Los controles de calidad quedan agrupados en tres niveles de control: a. Nivel I: Ensayos de intercomparación, según disponibilidad. b. Nivel II: Materiales de referencia sin certificación externa y muestras fortificadas por el analista. 7.9 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS La forma como se expresan los resultados en el informe de ensayo es en mg/100g de Histamina.

8 Página 8 de 8 8. REGISTRO IDENTIFICACION RESPONSABLE TIEMPO RGG Registro preparación de soluciones estándares puros Técnico y profesional del laboratorio ALMACENAMIENTO MEDIO SOPORTE 5 años Papel LUGAR RESPONSABLE/ RECUPERACION Laboratorio de Toxinas marinas y micotoxinas/ Carpeta de estándares DISPOSICION Picado en trozos, basura normal RG Registro de análisis de Toxinas marinas y micotoxinas Técnico y profesional del laboratorio 5 años Papel Laboratorio de Toxinas marinas y micotoxinas/ Cuaderno foliado Picado en trozos, basura normal 9. TABLA DE MODIFICACIONES VERSION FECHA PRINCIPALES PUNTOS MODIFICADOS RESUMEN DE MODIFICACIONES Se modifica documento a nuevo formato institucional, pasa de PRT a ME Se agregan condiciones cromatográficas 10. CUADRO DE RESPONSABILIDADES Ejecuta el método Técnico o Encargado de Laboratorio Elabora el informe de resultados Encargado Laboratorio de Aprueba el informe de resultados Jefe de Sección Química de Alimentos y Jefe de Subdepartamento 11. ANEXOS No Aplica