Técnicas moleculares para

Transcripción

1 Técnicas moleculares para detectar enfermedades vasculares en cítricos Isidro Humberto Almeyda-León Mario Alberto Rocha-Peña Fermín n Orona-Castro María a Magdalena Iracheta-Cárdenas rdenas Reyna Xochitl Loredo-Salazar

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4 VIRUS TRIZTEZA DE LOS CITRICOS

5 Síntomas asociados al CTV Arboles sobre patrón n de naranjo agrio Arboles sobre patrones distintos al naranjo agrio

6 Genoma del Virus Tristeza de los CítricosC 5 HEL Pol p6 p61 p16 p20 p33 p65 p27 p25 p13 p23 3 ssarn Virology (1995) 208: ; 520; J. Gen. Virol. (1996) 77: ; 2364; Phytopathology (1995) 86: ; 1335; Virus Genes (1993) 7:

7 Colección de aislamientos del VTC Extracción del ARN Reacciones de reverso transcipción ( RT) y en cadena de la polimerasa (PCR) Visualización de fragmentos de cadn del del gen de la proteína de la cápside del VTC en agarosa 3%

8 Extracción de RNA de cítricos mediante el método de extración simple (1-3) y por el método de cromatrogarfía en columna de celulosa (4-6)

9 M M 1500 pb 1500 pb Amplificación del gen p27 del VTC amplificados por RT-PCR usando los iniciadores CN167/CN168. M = Marcador de peso molecular Ladder 100, Línea 1= Arbol de naranjo sano, Líneas 2-4= Arboles de naranjo positivos

10 M M 1500 pb 1500 pb Fragmentos del VTC, amplificados por RT-PCR-Bidireccional. M = Marcador de peso molecular Ladder 100, Línea 1= Arbol de naranjo sano, Líneas 2 y 3= Arboles de naranjo infectados con raza severa del VTC, Líneas 4-6= Arboles de naranjo infectados con raza severa y raza débil del VTC.

11 M M 1500 pb 1500 pb Fragmentos del VTC, amplificados por RT-PCR-Bidireccional. M = Marcador de peso molecular Ladder 100, Línea 1= Arbol de naranjo sano, Líneas 2 y 3= Arboles de naranjo infectados con raza severa del VTC, Líneas 4 y 5= Arboles de naranjo infectados con raza débil del VTC, Líneas 6-8= Arboles de naranjo infectados con raza severa y raza débil del VTC.

12 M M 1500 pb 1500 pb Fragmentos del VTC, amplificados por RT-PCR-Bidireccional a partir de tejido de colecta reciente. M = Marcador de peso molecular Ladder 100, Línea 1= Testigo sano sano, Líneas 2 y 3= Arboles de naranjo infectados con raza severa (CEGET), Líneas 4-6= Arboles de naranjo infectados con raza atenuada del VTC (Veracruz), Líneas 7-8= Arboles de naranjo infectados con raza atenuada del VTC (Puebla).

13 1500 pb M M 1500 pb Fragmentos del VTC, amplificados por RT-PCR-Bidireccional a partir de tejido con un tiempo de colecta de 10 meses. M = Marcador de peso molecular Ladder 100, Línea 1= Testigo sano sano, Líneas 2-5= Arboles de naranjo infectados con raza atenuada del VTC (Veracruz), Líneas 6-8= Arboles de naranjo infectados con raza atenuada del VTC (Puebla).

14 2.- Caracterización n molecular de patógenos que infectan a cultivos de importancia agrícola

15 Perfiles electroforéticos de fragmentos desnaturalizados de ácidos nucleicos (SSCP) de dieciseis aislamientos del CTV del estado de Nuevo León cadn del CTV Electroforesis en condiciones desnaturalizantes cadn de razas del CTV tipo cadn de aislamientos del CTV de Nuevo León

16 VIROIDE EXOCORTIS

17 VIROIDE CHACHEXIA

18 Síntomas asociados a viroides en limón n Persa Agrietamiento de ramas en la copa Lesiones de color café y exudación n de goma en patrón macrofila

19 Implementación de las técnicas moleculares electroforesis secuencial (spage) y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para la detección de viroides Planta de cítricos infectada por viroides Extracción del ARN M M Reacción de RT: Formación de cadn a partir del ARN del viroide. Reacción de PCR: Millones de copias del genoma del viroide Gel de agarosa 1.5% para visualización de fragmentos de cadn amplificados

20 Implementación de las técnicas reverso transcripción reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para la detección de viroides Planta de cítricos infectada por viroides Extracción del ARN M M Reacción de RT: Formación de cadn a partir del ARN del viroide. Reacción de PCR: Millones de copias del genoma del viroide Gel de agarosa 1.5% para visualización de fragmentos de cadn amplificados

21 M M 1500 pb pb Visualización n de fragmentos de cadn de viroides.. M: Marcado de peso molecular Ladder 100, Líneas L 1 y 2: Exocortis,, Líneas L 3 y 4: Cachexia,, Líneas L 5 y 6: Grupo III, Líneas L 7 y 8: Exocortis, Cachexia y Grupo III.

22 1500 pb 600 M M 1500 pb Visualización n de fragmentos de cadn de viroides.. M: Marcado de peso molecular Ladder 100, Líneas L 1 y 5: Naranjos sanos, Líneas L 2 y 6: Cachexia y Grupo III, Líneas L 3, 4, 7 y 8 : Exocortis, Cachexia y Grupo III.

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24 M M 1500 pb 1500 pb Reacción de RT-PCR con muestras de cítricos para la detección del virus de la psorosis. M= Marcador de peso molecular Ladder 100, Línea 1= Cítrico sano crecido en invernadero; Línea 2= Naranja dulce, testigo positivo para psorosis, Línea 3-8= Muestras GT01 1-9, GT , MM , MM , MM , A

25 m m m M2 CCaVd CSVd CEVd Productos de PCR obtenidos con iniciadores específicos para exocortis(a) y electroforesis secuencial (B) del RNA extraído a partir de muestras de árboles de naranjo dulce del lote de variedades tempranas colectadas en el CEGET, N.L. m1 CSVd,, m2 CEVd y CCaVd.. Los números n corresponden a variedades de naranjo y las flechas indican la movilidad de los viroides señalados y el fragmento amplificado de 370 pb aprox.

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27 A B Reacción n de hibridación n con las sondas A. LY269 y B. PW1.2, con ADN de diferentes especies de plantas infectadas con fitoplasmas

28 GRACIAS