DETERMINACIÓN DEL COLESTEROL PLASMÁTICO TOTAL Y EL ASOCIADO A DISTINTOS TIPOS DE LIPOPROTEÍNAS

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1 CURSO Colesterol Ampliación del Metabolismo 1 DETERMINACIÓN DEL COLESTEROL PLASMÁTICO TOTAL Y EL ASOCIADO A DISTINTOS TIPOS DE LIPOPROTEÍNAS 1.- FUNDAMENTO TEÓRICO COLESTEROL TOTAL El colesterol es un lípido de naturaleza esteroide presente en las células de los tejidos animales. Es un compuesto de carácter hidrofóbico y, por consiguiente, poco soluble en medios acuosos como el plasma. Se puede encontrar libre o esterificado con ácidos grasos, y ambas formas circulan en la sangre unidas a diversas proteínas, constituyendo las lipoproteínas plasmáticas. La determinación de la concentración plasmática de colesterol tiene gran interés clínico, pues está demostrada la relación entre los niveles altos de colesterol y la incidencia de aterosclerosis, cardiopatía isquémica y otras enfermedades. El riesgo cardiovascular comienza a ser valorable cuando el colesterol total excede los 200 mg/dl (0.52 mm) aproximadamente. Los primeros métodos para la determinación del colesterol se basaban en la formación de compuestos coloreados mediante reacciones químicas del colesterol. No obstante, debido a los líquidos corrosivos que utilizan, estos métodos actualmente no se suelen emplear para los análisis de rutina, habida cuenta de que se han desarrollado métodos enzimáticos, igualmente específicos, de fácil manejo y de gran sensibilidad. En estos métodos enzimáticos, la primera reacción consiste en la hidrólisis de los ésteres de colesterol por acción de esterasas bacterianas, inespecíficas con respecto al ácido graso esterificado; a continuación se produce la oxidación del colesterol (el formado en la reacción anterior y el preexistente, o colesterol libre en plasma) por una colesterol oxidasa, produciéndose H 2 O 2, el cual con la participación de peroxidasa da lugar a la formación de un compuesto coloreado. Un esquema de las reacciones acopladas puede ser el siguiente: Ensayo de colesterol total (libre+esterificado) Ésteres de colesterol Colesterol esterasa (Colesterol esterificado) Ensayo de colesterol libre 4-Aminoantipirina + Fenol una Quinonaimina (coloreada, λ máx.=505 nm) O 2 H 2 O 2 Colesterol Colesterol oxidasa + 4-Colestenona Peroxidasa H 2 O + Ácido graso Para la determinación del colesterol libre se suprime la colesterol esterasa en el medio de ensayo, y el colesterol esterificado se calcula por diferencia entre el total y el libre. 1.2 COLESTEROL EN FRACCIONES LIPOPROTEICAS El colesterol, junto con el resto de lípidos muy poco solubles como los triacilgliceroles (o triglicéridos) y los fosfolípidos, circula en la sangre asociado a proteínas específicas (apolipoproteínas) formando complejos macromoleculares denominados lipoproteínas. Mediante ultracentrifugación se pueden separar al menos tres grandes clases de lipoproteínas, según su densidad: VLDL, LDL y HDL; cada una posee propiedades diferentes (ver tabla) y presenta un papel metabólico claramente diferenciado. En resumen: - las VLDL transportan triglicéridos desde el hígado hacia el resto de los tejidos - las LDL transportan colesterol - las HDL recogen el exceso de colesterol de los tejidos y lo llevan hasta el hígado para su eliminación. En correspondencia con su función, se ha observado que los niveles de colesterol asociado a LDL (y a VLDL) correlacionan directamente con el riesgo cardiovascular, mientras que el colesterol en HDL presenta una relación inversa. Por ello, resulta clínicamente interesante cuantificar el colesterol asociado a cada una de las lipoproteínas, además del colesterol total en plasma.

2 CURSO Colesterol Ampliación del Metabolismo 2 Propiedades fisico-químicas de algunas de las lipoproteínas del plasma humano VLDL LDL HDL densidad (g/ml) tamaño (nm) migración electroforética pre-β β α composición (en peso): proteínas 8 % 22 % 50 % triacilglicéridos 55 % 6 % 8 % fosfolípidos 18 % 22 % 22 % colesterol libre 7 % 8 % 3 % ésteres de colesterol 12 % 42 % 14 % ácidos grasos libres trazas trazas 3 % Como la ultracentrifugación (que separa por densidad) es una técnica laboriosa y costosa, se han desarrollado otros métodos alternativos para separar las lipoproteínas plasmáticas, entre los cuales figuran los de precipitación selectiva mediante polianiones. Las lipoproteínas forman complejos insolubles con diversos compuestos polianiónicos, particularmente polisacáridos sulfatados como la heparina y el dextransulfato, en presencia de concentraciones adecuadas de cationes divalentes (Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+ ). Debido a las diferentes propiedades físico-químicas de los distintos tipos de lipoproteínas, algunas precipitan con más facilidad que las otras; en concreto, en el orden siguiente: VLDL, LDL, HDL. Por ello, ajustando adecuadamente las concentraciones de polianiones y de cationes puede lograrse la precipitación de las VLDL y LDL sin que precipiten las HDL. Esto permite medir el colesterol asociado a las HDL (C HDL ) aplicando el método de determinación al sobrenadante obtenido tras la precipitación. Conociendo la concentración de triglicéridos totales (TGT) (que circulan mayoritariamente en las VLDL, salvo casos patológicos) se puede estimar el colesterol asociado a las VLDL (C VLDL ) según la fórmula: [C VLDL ] = 0.2 x [TGT] con lo cual el colesterol asociado a LDL se podrá calcular así: [C LDL ] = [C T ] [C HDL ] [C VLDL ] (determinación directa en plasma) (determinación en sobrenadante de precipitación) (0.2 x [TGT]) Estos métodos de precipitación son satisfactoriamente exactos (con respecto a los valores de referencia que se obtienen por ultracentrifugación) pero adolecen de una cierta inespecificidad, es decir, precipitan algunas HDL mientras que no lo hacen algunas LDL. Esto exige que las condiciones en que se practiquen estos métodos estén perfectamente normalizadas para obtener una exactitud aceptable. En este sentido, dado que las interacciones entre los precipitantes y las lipoproteínas son de carácter iónico, debe mantenerse constante la fuerza iónica de la muestra; según sea el polianión empleado habrá que evitar la presencia de otros aniones que impidan su acción; finalmente, si se pretende valorar el colesterol de las HDL por métodos enzimáticos, deberá conocerse si los cationes empleados inhiben las enzimas o interfieren en el método de ensayo. A pesar de todas estas consideraciones, los métodos de precipitación son muy valiosos para la determinación rutinaria de C HDL y están ampliamente extendidos en todos los laboratorios de análisis clínicos. En la presente práctica se analizará cómo afecta el ion Mn 2+ a la determinación del colesterol propiamente dicha y se comprobará también que la alta fuerza iónica (debida a un exceso de NaCl) interfiere en la formación de los complejos polianión-lipoproteína. De estos ejemplos prácticos debe deducirse que la aplicación de cualquier método de precipitación de las lipoproteínas debe realizarse en condiciones perfectamente definidas y que la variación de alguna de ellas debe estar precedida por una rigurosa comprobación de los resultados.

3 BIBLIOGRAFÍA CURSO Colesterol Ampliación del Metabolismo 3 L.A. Kaplan y A.J. Pece: Clinical chemistry: theory, analysis and correlation. Mosby, St.Louis, 1984 G.R. Warnick: Enzymatic methods for quantification of lipoprotein lipids. En Methods in Enzymology, Vol. CXXIX: Plasma lipoproteins, part B (eds. J.J. Albers y J.P. Segrest). Academic Press, Orlando, pp (1986). P.S. Bachorik y J.J. Albers: Precipitation methods for quantification of lipoproteins, en Methods in Enzymology, Vol. CXXIX: Plasma lipoproteins, part B (eds. J.J. Albers y J.P. Segrest). Academic Press, Orlando, pp (1986) 2.- MATERIAL Y REACTIVOS MATERIAL Centrífuga Cubetas de colorimetría Colorímetros Tubos de plástico de 10 ml Tubos de plástico de 3 ml Pipetas automáticas p50 y p1000 REACTIVOS Disolución patrón de colesterol, 200 mg/dl NaCl 0,15 M NaCl 5 M Heparina 14,5 mg/ml, MnCl 2 1 M REACTIVOS Disolución de enzimas, que contiene: tampón PIPES ph 7; 35 mm colato sódico (tensioactivo y detergente) 0,5 mm 4-aminoantipirina 0,5 mm fenol 28 mm peroxidasa >0,8 U/mL colesterol oxidasa >0,1 U/mL colesterol esterasa >0,2 U/mL Muestra: suero fetal bovino 3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Resumen del propósito de los distintos tubos de ensayo en la práctica: Control de la precipitación A) Influencia de la fuerza iónica sobre la precipitación de lipoproteínas con heparina y Mn 2+ Tubo A Precipitación a baja concentración de NaCl Tubo B Precipitación a alta concentración de NaCl Tubo C Blanco de reactivos de precipitación, en ausencia de suero y en presencia de Mn 2+ y heparina SN A SN B SN C Tubo 3 ( [NaCl] baja) Tubo 4 ( [NaCl] alta ) B) Interferencia del Mn 2+ con el método de determinación de colesterol Tubo 5 Blanco de reactivos Ensayo de determinación Tubo 1 Patrón de colesterol, para calibrar el ensayo Tubo 2 Muestra de plasma o suero, para determinar colesterol total Tubos 3 a 5 s de precipitación de lipoproteínas, para comprobar las condiciones de precipitación y para determinar colesterol asociado a HDL a) Preparar 3 tubos de 3 ml y pipetear en ellos lo siguiente: tubo nº suero NaCl 0.15 M NaCl 5 M reactivo Heparina-Mn 2+ A 500 µl 500 µl µl B 500 µl µl 100 µl C µl µl - Mezclar bien y dejar reposar los tubos 20 minutos. Observar y anotar el aspecto de cada tubo (turbidez, color,...). - Centrifugar a 1500 x g durante 15 minutos. Observar el aspecto y tamaño del precipitado. - Trasvasar el sobrenadante (SN) a otros tubos con cuidado de no remover el precipitado; estos sobrenadantes de los tubos A, B y C se usarán para preparar los tubos 3, 4 y 5, respectivamente.

4 CURSO Colesterol Ampliación del Metabolismo 4 b) Preparar 6 tubos de ensayo de 10 ml y pipetear en ellos lo siguiente: tubo nº patrón suero sobrenadante NaCl 0.15 M Disolución de enzimas Absorbancia ml 2 ml 1 20 µl ml 2 ml µl ml 2 ml µl del SN-A* -- 2 ml µl del SN-B* -- 2 ml µl del SN-C* -- 2 ml (*) SN se refiere al sobrenadante de los tubos anteriores A, B y C. - Mezclar e incubar 15 min a temperatura ambiente. Observar y anotar el aspecto de la disolución, color y turbidez. - Leer la absorbancia a 505 nm frente al tubo 0 (blanco). La coloración es estable unos 30 minutos a temperatura ambiente. 4.- TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS Indicar para cada tubo si se formó precipitado, su cantidad y color, y si el sobrenadante obtenido tras la centrifugación estaba turbio. Indicar también el aspecto (color, intensidad, turbidez) tras añadir la disolución de enzimas Identificar el tipo de colesterol determinado en cada tubo: total o asociado a lipoproteínas, especificando el tipo de lipoproteína En función del punto anterior, calcular la concentración de colesterol total en la muestra de suero, expresándola en mg/dl de suero. Calcular también la concentración de colesterol asociado a HDL (C HDL ) expresándola en las mismas unidades Calcular la concentración de C LDL en el suero, suponiendo que la concentración de triglicéridos en la muestra era de 9 mg/dl, Explicar la influencia de la concentración salina (NaCl) en la precipitación de lipoproteínas en los tubos A, B y C Se ha producido interferencia del reactivo de heparina-mncl 2 en la determinación colorimétrica del colesterol?. Explicar. 5.- OBSERVACIONES

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