LAS TRANSLOCACIONES DE RAF PARTICIPAN EN EL CANCER

Transcripción

1 Genética Molecular 10/11 Ana Serrano Puebla LAS TRANSLOCACIONES DE RAF PARTICIPAN EN EL CANCER En este trabajo se dispusieron a investigar sobre el desarrollo y mantenimiento de células cancerígenas en próstata, estómago y melanomas. Se observó que aproximadamente entre 1-2% de estos cánceres están provocados por translocaciones de genes de la familia RAF; este porcentaje afecta a unas personas cada año solamente en Estados Unidos. Esta familia de proteínas son partícipes de una vía de transducción de señales que provoca proliferación y división celular. Esta ruta se activa por factores de crecimiento extracelulares, que son recibidos por receptores tirosina quinasa, que activa a proteínas de la familia Ras y se produce una reacción en cadena de fosforilaciones que activan a las siguientes quinasas de forma consecuente: RAF, MEK y ERK. Por último, esta última proteína activa a ETS, que es un factor de transcripción que entra al núcleo y se une al DNA para permitir la expresión de determinados genes. Cuando esta ruta está mutada, se puede producir una sobreexpresión de estas proteínas y su actividad quinasa puede verse aumentada, produciendo un incremento en la proliferación celular, y generando células cancerígenas. Aunque la mayoría de mutaciones en RAF se producen por mutaciones puntuales (hoy en día se conocen más de 60 mutaciones puntuales de RAF), esta investigación se centró principalmente en translocaciones. Estudios con ratones (donde se modificó la expresión de este gen para que fuera constitutiva) han demostrado que mutaciones de BRAF (proteína de la familia RAF implicada también en cáncer de mama) pueden desencadenar la iniciación de cáncer; sin embargo, ensayos clínicos de inhibidores de las RAF quinasas, han provocado un choque contra melanomas avanzados, lo cual indica que también está relacionado con el mantenimiento de dicha enfermedad. Por lo tanto, la familia RAF es conocida por tener un papel fundamental en la transducción de señales, desde RAS a MAP quinadas (ERK, MEK). En este trabajo se estudia la importancia de las fusiones de los genes SLC45A3-BRAF y ESRP1-RAF1, que aparecen en cáncer de próstata, y de AGTRAP-BRAF, en cáncer de estomago, ya que inducen a una excesiva fosforilación de MEK, y por lo tanto, de ERK. 1

2 Fig1. Fusiones de genes relacionados con RAF en cáncer gástrico, de próstata y en melanoma. La familia de proteínas RAF se activan por RAS GTPasas. A su vez, las quinasas RAF activan a otras quinasas MEK1 y MEK2 gracias a una fosforilación en serinas en dos sitios del segmento de activación en el dominio quinasa. MEK1 y MEK2 activan las ERK quinasas por fosforilación de treoninas y tirosinas en el segmento de activación del dominio quinasa. Ahora, el objetivo de ERK son los factores de transcripción de la familia ETS, que también está implicada en carcinogénesis ya que los genes ETS suelen aparecer translocados. Se identificaron las fusiones SCL45A3-BRAF y ESRP1-RAF1 en cáncer de próstata, y AGTRAP-BRAF en cáncer gástrico. La característica común de estas tres fusiones es que el dominio quinasa de RAF es activo de forma constitutiva. Para encontrar qué genes estaban translocados, secuenciaron los cdnas provenientes del cáncer de próstata e identificaron los mrnas resultantes de las fusiones; esta técnica se llama paired-end transcriptome sequencing. Para discriminar verdaderas fusiones de los falsos positivos, desarrollaron un sistema de priorización y validaron con células que sabían que tenían translocaciones en el cromosoma del gen ETS. Encontraron dos fusiones principales: 1) SLC45A3-BRAF. El primer gen expresa para una proteína canal (carrier), que está en el cromosoma 1, y que es un regulador de andrógeno que se expresa exclusivamente en la próstata. El gen BRAF, de la familia de RAF, está situado en el cromosoma 7 y mantiene su actividad quinasa. La translocación permite que el gen BRAF mantenga su actividad quinasa, pero el gen SCL45A3 apenas llega a codificarse, ya que sólo expresa un exón de los 5 que posee. 2) ESRP1-RAF1. El primer gen expresa para un factor de regulación de splicing endotelial, localizado en el cromosoma 8; está fusionado con el gen RAF1 del cromosoma 3. No se sabe si las secuencias codificantes de ESRP-1 tienen una acción fundamental en el desarrollo oncogénico; aunque, los datos apuntan a que la actividad quinasa de RAF1 es la esencial. 2

3 Para conseguir llegar a esto, usaron distintas muestras de cáncer de próstata y buscaron coincidencias de genes translocados. Fig.2 Estudio de fusiones de los genes SLC45A3-BRAF y ESRP1-RAF1 en cáncer de próstata por paired-end transcriptoma sequencing. (a) Histogramas que representan las fusiones y el score de las veces que aparece en las muestras de cáncer de próstata PCA1, PCA2, PCA3 y PCA17, estudiando AX ETV1,TMPRSS2-ERG, SLC45A3- BRAF, ESRP1-RAF1 y RAF1-ESRP1, respectivamente, y una muestra de cáncer gástrico, GCT15, estudiando AGTRAP- BRAF. Estos genes principales están remarcados en rojo. Otros genes que también aparecen están marcados en negro. (b) Representación esquemática de la lectura de la translocación entre el gen SLC45A3 (morado) y BRAF (naranja). El dominio quinasa de la proteína BRAF sigue intacto en la translocación. (c,d) Al igual que en b, muestra el gen ESRP1 (rojo) con RAF1 (azul), que indica la translocación recíproca ESRP1-RAF1 y RAF1-ESRP1. (e) Como en b, enseña la fusión entre AGTRAP (rojo) y BRAF (naranja). El dominio quinasa de la proteína BRAF sigue intacto en la translocación. Se buscaron entonces las translocaciones, utilizando la validación de las secuencias ETS (ETS-positivas, o ETS-negativas) y mediante FISH y PRC-cuantitativa se hallaron 5 fusiones ETS-positivas, y 10 ETS-negativas. Las muestras ETS-negativas más relevantes son las mostradas en las gráficas de la Fig.2: PCA1, PCA2, PCA3, PCA17, GCT15. En las dos muestras llamadas PCA3 y PCA17 se encontraron fusiones que incluían los genes BRAF y RAF1. Estas fusiones pertenecen a proteínas de la vía Ras. - PCA3 tiene en su mayor parte, una fusión de BRAF y SCL45A3. Además advirtieron de que esta proteína fusionada está muy sobreexpresada. - PCA17 tiene en su mayor parte una fusión para ESRP1 y RAF1, formado por una fusión recíproca, es decir, aparecen tanto fusiones RAF1-ESRP1, como ESRP1- RAF1. 3

4 Fig.3. Validación experimental de los genes fusionados SLC45A3-BRAF, ESRP1-RAF1 y RAF1-ESERP1, y AGTRAP-BRAF en muestras de tumor de próstata. (a) Expresión de la fusión de SLC45A3-BRAF en PCA3. (b) ESRP1-RAF1 y RAF1- ESRP1 en PCA17 (lo que demuestra fusiones recíprocas). (c) AGTRAP-BRAF en GCT15. Estas tablas están validadas por PCR-cuantitativa. (d) FISH: SCL45A3-BRAF en PCA3 a la izquierda, el color verde indica para el cromosoma 1 (donde está SCL45A3), y el rojo para el cromosoma 7 (donde se sitúa BRAF). Vemos que hay dos fusiones (color amarillo), y ESRP1-RAF1 en PCA17 a la derecha. El verde para el cromosoma 8 (donde está ESRP1), y el rojo para el cromosoma 3 (RAF1). (e) FISH: reordenamientos de BRAF en el tumor de GCT15, verde y rojo indican reordenamientos, donde hay luz amarilla es un cromosoma normal. La imagen de la derecha muestra delecciones en el extremo 5 de BRAF. (f) FISH: en melanoma (muestra llamada MEL23), reordenamientos causados por BRAF (izquierda) y RAF1 (derecha). Verde y rojos individualmente indican reordenaciones, y el amarilla indica cromosoma normal. (g) Expresión de la proteína ESRP1-RAF1 en el caso PCA17; fusiones ESRP1-BRAF fueron detectadas con un anticuerpo contra la región c-terminal de RAF1. Células HEK293 que expresan ESRP1-RAF1, fueron usadas como control positivo. Beta-actina sirve como un control de carga. (h) Expresión de la proteína de fusión AGTRAP-BRAF en caso GCT15. Utilizando FISH, pudieron localizar las fusiones en el núcleo celular de las distintas muestras, gracias a sondas con distintos colores que permiten observar si hay translocaciones cromosómicas o delecciones. Los resultados se pueden observar en la Fig.3 donde se advierte que sí se producían dichas translocaciones. También se han observado estas fusiones en canceres de melanoma, mama, gástrico, del endometrio y del hígado. Estudiando en células 3T3, línea celular de fibroblastos de ratón, se observaron sobreexpresiones de SLC4513-BRAF, que formaban tumores; sin embargo, en este mismo tipo celular pero que sobreexpresa ESRP1-RAF1, no formaron tumores, lo que quizás indica las diferencias de señalización entre distintos tipos de proteínas de fusión. Como ya se ha dicho, esta vía es medicable, y por lo tanto, se estudió el potencial de estos medicamentos sobre estas muestras. 4

5 Fig.4. (a) Inhibidores de RAF y MEK bloquean fenotipos de los genes fusionados de SLC45A3-BRAF y ESRP1-RAF. Las células cancerígenas de próstata son sensibles a sorafenib y un inhibidor de MEK llamado U0126 (pruebas con 1M y 10M). (b) Cuantificación de las células por absorbancia. (c) Fotomicrografía. (d) Cuantificación de colonias crecidas en agar. (e) Evaluación, mediante Western blot, de la vía de señalización dowstream activada por las fusiones SLC45A3-BRAF y ESRP1-RAF1. Como control positivo se utilizó una línea celular de melanoma. Como se ha mencionado al comienzo, estas fusiones provocan un aumento de la capacidad de fosforilación de las quinasas MEK y ERK. Por lo tanto, si suministramos un inhibidor de estas quinasas, podemos bloquear los sucesos consecuentes. Para examinar el papel de estas proteínas fusionadas, se sobreexpresó SLC45A3-BRAF y ESRP1-RAF1 en determinadas células. Ambas fusiones de genes provocaron el aumento de la proliferación celular, pero esta capacidad es sensible a sorafenib, que es un inhibidor de RAF cuyo objetivo es cambiar la conformación del segmento activo de RAF para que no pueda seguir fosforilando. Además observamos que también son sensibles al inhibidor de MEK, U0126. Pese a los buenos resultados de estos experimentos, se sigue investigando mediante otras vías: otro grupo de investigación estudió el bloqueo de las células cancerígenas a partir de oligonucleótidos antisense, pero cuando probaron la medicina in vivo, los resultados no fueron demasiado beneficiosos. Actualmente también se ha decidido experimentar con Small Interfiring RNA s (sirna), ya que se ha probado que es capaz de evitar la proliferación y la invasión de células con RAF mutado, sin provocar apoptosis general. Estos resultados remarcan el papel de la importancia de la vía RAF en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata. Además, aunque en humanos es raro, en ingeniería con células de ratón se ha observado que también pueden colaborar en el desarrollo de cáncer invasivo. 5

6 Secuenciar los transcritos en tumores puede servirnos para identificar distintos tipos de cáncer. Examinar los tipos de fusiones de RAF puede ser útil para identificar a las personas que les pueda resultar ventajoso medicarse con inhibidores de RAF. Este estudio de los reordenamientos de la vía RAF que son el 1-2% de próstata, estómago y melanomas supone que la principal distinción en el cáncer debería ser por los eventos moleculares que en él suceden, y no por el órgano donde se encuentra. Es decir, debería ser esencial un análisis clínico a nivel molecular, previo a la medicación para obtener una terapia personalizada, que, a diferencia de la terapia convencional que mata toda célula que intenta entrar en división, la personalizada interfiere contra las proteínas que estén involucradas en el mantenimiento del cáncer. Referencias: - McMahon, M. (2010) RAF translocations expand cancer targets. Nat. Med. 16, (2010). - Palanisamy, N. et al. Nat. Med. 16, (2010). - Khazak, V., Astsaturov, I., Serebriiskii, I.G. & Golemis, E.A. Expert Opin. Ther. Targets 11, (2007). Bibliografía: - Biología molecular de la célula, Alberts, Johnson, Lewis, (5ªED). 6