PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA (CURSO )

Transcripción

1 PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA (CURSO )

2 PRÁCTICAS A REALIZAR ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ORINA ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA M-1 M-2 M-3 M-4 Lectura de la placa de Agar CLED Identificación presuntiva de las colonias crecidas en las placas de Agar Cromogénico y Agar MacConkey Tinción de Gram de colonias aisladas en las placas de Agar Cromogénico y Agar MacConkey Prueba de la citocromo-oxidasa a la presunta enterobacteria M-5 Siembra de la colonia seleccionada en Agar MacConkey

3 LECTURA Y CONCLUSIONES DEL ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LA MUESTRA DE ORINA FUNDAMENTO Tratamos de conocer el número de microorganismos presentes por cada mililitro de orina. Independientemente del número, la presencia de ciertos microorganismos, por ejemplo, levaduras o estafilococos en cultivo puro, es suficiente para considerar que existe un proceso infeccioso. METODOLOGÍA Como hemos sembrado 1μL de muestra, si multiplicamos el número de UFC (unidades formadoras de colonias) que aparezcan en la placa por 1.000, obtendremos el número de microorganismos presentes por cada ml de orina. La OMS recomienda utilizar el índice de Kass (10 5 UFC/mL de orina) como umbral para considerar o no la existencia de una posible infección (> 10 5 UFC, bacteriuria significativa). De todas formas, este valor es sólo indicativo, ya que hay personas que presentando valores superiores al índice de Kass, están perfectamente sanas y otras, en cambio, tienen infección en el tracto urinario (ITU) aun cuando no presentan más de 10 2 ó 10 3 UFC/mL de orina.

4 ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ORINA Lectura de la placa de Agar CLED Inoculada con un volumen de 1 μl de orina Contar el número de UFC en la placa Ejemplo: Nº UFC/µL = 35 Nº UFC/mL = 35 x 10 3 = 3,5 x 10 4 Nº UFC/mL = 0,35 x 10 5 Nº > 10 5 / ml 10 5 /ml > Nº > 10 4 /ml Nº < 10 4 / ml Nº BACTERIAS EN ORINA Bacteriuria significativa Probable infección Diagnóstico dudoso Debe repetirse el análisis Bacteriuria no significativa Probable contaminación

5 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA Identificación presuntiva de colonias Utilizaremos las placas: Agar de MacConkey Agar Cromogénico Moderadamente selectivo No selectivo Observaremos la pigmentación de las colonias y consultaremos la tabla.

6 AGENTES MICROBIANOS AISLADOS FRECUENTEMENTE EN INFECCIONES URINARIAS FRECUENTES POCO FRECUENTES INDIVIDUO SIN FACTORES PREDISPONENTES Escherichia coli Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae Enterococos Staphylococcus saprophyticus INDIVIDUO CON FACTORES PREDISPONENTES Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Otras enterobacterias Enterococos Staphylococcus epidermidis Candida albicans Corynebacterium urealyticum

7 Fermenta la lactosa Agar de MacConkey No fermenta la lactosa

8 Prácticas de Microbiología Clínica (Curso ) Agar de MacConkey Zona oscurecida alrededor de las colonias debida al precipitado de las sales biliares cuando el medio se hace fuertemente ácido

9 FERMENTACIÓN DE LA LACTOSA POR ENTEROBACTERIAS Microorganismo Fermentador de lactosa Tipo de fermentación de la glucosa Liberación de ácidos Liberación de CO 2 Escherichia coli Fuerte Ácido mixta Muchos Poco Enterobacter aerogenes Fuerte Butilén-glicólica Pocos Mucho Klebsiella pneumoniae Fuerte Butilén-glicólica Pocos Mucho Citrobacter Lento Ácido mixta Muchos Poco Serratia Lento Ácido mixta Butilén-glicólica Muchos Pocos Poco Mucho Salmonella, Shigella, Proteus, Edwarsiella y Providencia: no fermentan la lactosa

10 PIGMENTACIÓN DE COLONIAS BACTERIA CLED MACCONKEY CROMOGÉNICO Escherichia coli Amarillo (grandes) Rojo-rosa (precipitado) Rosa Klebsiella Amarillo-azulblanquecino Rosa (mucosa) Azul oscuro Púrpura Proteus Azul translúcido Incolora Halo marrón Salmonella Azul Incolora - Pseudomonas aeruginosa Verde - Verde Marrón Staphylococcus aureus Amarillo dorado No crece Blanco Crema S. epidermidis Amarillo pálido No crece Rosa Blanco pálido Enterococcus faecalis Amarillo No crece Azul Turquesa Estreptococcus - No crece Blanco

11 Se realizarán tinciones de Gram a colonias aisladas y se observarán al microscopio Interesan únicamente las colonias que se correspondan con bacilos Gram negativos Se seleccionará una de estas colonias y se le realizará la prueba de la oxidasa La prueba de la oxidasa debe salir negativa (todas las enterobacterias son oxidasa negativas)

12 Tinción de Gram 1. Extensión. 2. Desecación. 3. Fijación. 4. Colorante: Cristal violeta, 2 minutos. 5. Lavar con agua. 6. Mordiente: Lugol, 2 minutos. 7. Lavar abundantemente con agua. 8. Decoloración: Alcohol etílico 96%, 20 segundos. 9. Lavar abundantemente con agua. 10. Colorante de contraste: Safranina, 3-4 minutos. 11. Lavar abundantemente con agua. 12. Dejar secar a temperatura ambiente. 13. Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100X).

13 Gram positiva Gram negativa Extender y fijar la preparación Cristal violeta Lugol Etanol Safranina

14 Tinción de Gram Gram negativas Gram positivas

15

16 Prueba de la citocromo oxidasa Fundamento Determinar la presencia del enzima citocromo c oxidasa. Procedimiento Depositar unas gotas de reactivo (tetrametil-p-fenilén diamina) sobre un papel de filtro. Inmediatamente, con la ayuda de un palillo estéril extender un inóculo de la bacteria sobre el papel de filtro impregnado de reactivo. Prueba positiva Aparición de color azul-violeta intenso en segundos, debido a la formación de azul de indofenol. Control positivo Pseudomonas aeruginosa. - +

17 SIEMBRA DE LA COLONIA SELECCIONADA COMO PRESUNTA ENTEROBACTERIA EN PLACA DE AGAR DE MACCONKEY La colonia seleccionada debe cumplir: Haber sido aislada en Agar Cromogénico o en Agar de MacConkey Se corresponde con bacilos cortos Gram negativos Dar negativa la prueba de la oxidasa

18 Siembra por estrías en sectores de la placa de Agar de MacConkey