Replicación del DNA. En base a lo que conocemos de la estructura de DNA...

Transcripción

1 Replicación del DNA En base a lo que conocemos de la estructura de DNA La doble hélice de DNA con su apareamiento entre cadenas complementarias sugiere que cada cadena sirve como molde para la síntesis de una cadena hija 2. La conservación del contenido A/T y G/C en todas las células de un organismo

2 Posibles mecanismos de replicación n del DNA Hebras parentales Replicación Hebras hijas Estructura del DNA Doble Hélice Cadenas complementarias Semiconservadora Conservadora Dispersa al azar Pruebas experimentales?

3 Experimento de Meselson y Stahl Alimentar cultivo de E. coli con fuente de 14 N o 15 N y purificar el DNA Separación de DNA por centrifugación en gradiente de CsCl

4 Experimento de Meselson y Stahl Comprobación del mecanismo semiconservador de replicación Consistente con un mecanismo semiconservador Se deja otro ciclo de replicación

5 DNA bacteriano durante replicación

6 Es la replicación del DNA unidireccional o bidireccional? En bacterias, que tienen genoma circular cerrado Replicación del DNA de E. coli por 1.5 generaciones en presencia de nucleótidos marcados Autoradiografía

7 Demostración experimental Experimento de Gyurasits y Lake DNA de Bacillus subtilis Pulso de baja intensidad en el inicio Pulso de alta intensidad

8 Resultados del experimento de Gyurasits y Lake

9 Horquillas en ambas direcciones muestran marca fuerte, lo que indica que que fueron activas durante el segundo pulso. Ambas horquillas surgen de un punto inicial que es el origen de replicación. Las horquillas se mueven en direcciones opuestas. Evidencia de que la replicación del DNA es bidireccional y a partir de un origen de replicación

10 Reacción n básica b de la replicación n de DNA DNA polimerasa DNA n + dntp (DNA) n+1 + PPi Cada cadena de DNA sirve como molde para la síntesis de una cadena nueva Los substratos son desoxiribonucleósidos 5 fosfato (dntps: datp, dttp, dgtp, dctp) (nucleótidos) Las cadenas de DNA se separan y se sintetiza la hebra complementaria de cada una, de manera simultánea Las DNA polimerasas añaden dntps al molde de la cadena madre en dirección 5 a 3

11 La DNA polimerasa requiere un 3 OH libre para poder polimerizar Se produce un ataque nucleofílico lico del 3 OH 3 al fosfato α del dntp entrante DNA n dntp γ β α PPi γ β (DNA) n+1 α molde

12 Pero si La horquilla de replicación es bidireccional Las cadenas de DNA son antiparalelas Entonces. Y la DNA polimerasa solo sintetiza en dirección 5 a 3 Qué ocurre en la horquilla de replicación n para que se puedan sintetizar las dos hebras de manera complementaria y antiparalela, aún a n cuando la horquilla avanza en una dirección?

13 Mecanismos para explicar la síntesis s de las cadenas complementarias Síntesis continua requiere que las DNA polimerasas sintetisen DNA de 5 ->3 y de 3 -> 5 Síntesis discontinua las dos cadenas nuevas se sintetizan en fragmentos, en dirección de 5 ->3 Síntesis semidiscontinua una cadena se sintetiza en forma continua y la otra en forma discontinua, en dirección de 5 ->3. La replicación del DNA es semidiscontinua

14 Experimentos de Reiji Okazaki Durante la replicación del DNA se sintetizan fragmentos que varían entre 1000 a 2000 nucleótidos Explicación?

15 Replicación semidiscontinua: Una hebra se sintetiza en forma continua y la otra discontinua Cadena adelantada o guía (leading)/ Cadena retrasada (lagging) * 3 5

16 3 5 * 5 3 * Como la dirección de síntesis de la cadena discontinua es opuesta a la dirección de apertura de la horquilla, se comienza una nueva cadena. En cambio, la cadena continua simplemente se sigue alargando

17 Como la DNA polimerasa no puede polimerizar una hebra nueva de DNA si no cuenta con un cebador que tenga un 3 OH libre, es necesario que estos cebadores sean sintetizados previo a que la DNA polimerasa actúe Hebra guía continua Fragmentos de Okazaki Hebra retrasada discontinua El crecimiento de ambas cadenas es en sentido 5 3

18 Los cebadores son sintetizados por una DNA primasa La DNA primasa emplea ribonucleótidos para sintetizar los cebadores

19 Generalidades de la Replicación de DNA Semiconservadora A partir de un origen de replicación Bidireccional Semidiscontinua Requiere de un cebador de RNA

20 Origen de Replicación OriC En bacteria hay un solo origen de replicación Secuencias repetidas en tandem (13 pb) Cajas reconocidas por DnaA (9 pb) 1. Activación por metilación de A en GATC 2. Unión de DnaA abre el DNA 3. Unión de DnaB y DnaC- actividad helicasa ATP dependiente 4. Unión de SSB para mantener separadas las cadenas de DNA

21 El DNA cuando está superenrollado no se puede replicar. Proteínas que intervienen en la apertura de la doble hebra de DNA preparándola para ser replicada: DnaA, DnaB, DnaC, y HU en OriC

22 Proteína Dna A La proteína DnaA es un monómero de 52 kda. Tiene una muy alta afinidad por ATP (K d = 0.03 µm) y lo hidroliza lentamente a ADP en una forma dependiente de DNA. Tiene un dominio de unión a ATP. Se une con alta afinidad y de forma cooperativa a las cajas dnaa de oric y se ha calculado una estequiometría de 30 subunidades de dnaa por oric.

23 Reconocimiento del oric y formación del primosoma 1. La proteína HU causa torsiones en el DNA y facilita su unión a la proteína DnaA 2. La unión del complejo HU-ATP-DnaA desestabiliza la doble hélice en la región P1

24 Reconocimiento del oric y formación del primosoma 3. Unión de la proteína DnaA al origen de replicación. Depende de ATP. Desestabilización de la doble hélice en la región P1.

25 Proteína DnaB. Helicasa Monómeros de 50 kda que forman un homohexámero. Tiene dominios que se requieren para: Interacción con la proteína DnaC Unión a DNA de cadena sencilla Unión a DNA de cadena doble Activación de la primasa Hidrólisis de ATP La helicasa rodea una de las hebras del DNA duplex y se desplaza logrando la apertura de la doble hélice por exclusión estérica. Una hebra es excluida del canal interno, mientras que la otra hebra es retenida en el interior del anillo.

26 DnaB. helicasa Rompe los puentes de hidrógeno entre las bases

27 Reconocimiento del oric y formación del pre-primosoma 3. Unión de DnaB y DnaC a la región abierta del DNA.

28 Reconocimiento del oric y formación del primosoma 2. La unión del complejo HU-ATP-DnaA desestabiliza la doble hélice en la región P1 1. La proteína HU causa torsiones en el DNA y facilita su unión a la proteína DnaA 3. Unión de DnaB a la región abierta del DNA. Unión de DnaC a DnaB

29 Proteína SSB Single-strand binding La proteína SSB se une al DNA de cadena sencilla con alta afinidad y así previene que se vuelva a formar el híbrido DNA- DNA.

30 Proteínas de unión n a cadena sencilla (SSB) La unión de SSB es cooperativa y ayuda a la polimerasa facilitando su actividad

31 Estructura de las SSB

32 Una vez que se ha abierto el DNA y se evita su rehibridación o autohibridación, comienza la síntesis

33 Como la DNA polimerasa no puede polimerizar una hebra nueva de DNA si no cuenta con un cebador que tenga un 3 OH libre, es necesario que estos cebadores sean sintetizados previo a que la DNA polimerasa actúe Hebra guía continua Fragmentos de Okazaki Hebra retrasada discontinua El crecimiento de ambas cadenas es en sentido 5 3

34 DnaG Primasa La primasa es una proteína monomérica de 60 kda que sintetiza oligo-ribonucleótidos de 10 a 12 unidades de longitud, usando rntps. Es dependiente de molde y la secuencia corresponde al origen de replicación. El extremo 3 del último ribonucleótido es extendido como DNA por la acción de la DNA polimerasa. Se forma una unión covalente entre RNA y DNA

35 DNA primasa RNA polimerasa que sintetiza los cebadores de RNA

36 La DNA polimerasa III cataliza la reacción n de polimerización n durante la replicación

37 La actividad de DNA polimerasa cataliza la adición de un dntp al extremo 3 -OH de un polidesoxinucleótido complementario al DNA molde, por un mecanismo de desplazamiento nucleofílico.

38 Con un alto grado de fidelidad gracias a su actividad exonucleasa

39 Hay dos propiedades importantes de las DNA POLIMERASAS: FIDELIDAD Y PROCESIVIDAD La FIDELIDAD se refiere al seguimiento exacto de la secuencia que sirve como molde. En promedio, las DNA pols, 1 error por cada 10 8 nts La actividad de exonucleasa 3 5 de la DNA polimerasa contribuye a la fidelidad pues tiene actividad correctora (proofreading). Competencia cinética entre la actividad de Polimerasa y de Exonucleasa La PROCESIVIDAD se refiere a la capacidad de una DNA polimerasa de elongar una cadena de DNA por muchos nucleótidos antes de disociarse del complejo que forma con el sustrato. La DNA polimerasa I tiene una procesividad baja. Es distributiva. La DNA polimerasa III tiene una procesividad alta.

40 Actividad de exonucleasa 3 5

41 Si la síntesis no fuera de 5-3 la Polimerasa no podría efectuar el proofreading Mismatch

42 Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli Sub # por holoenzima Mr Función α 2 132,000 Actividad polimerasa ε 2 27,000 Exonucleasa 3 5 θ 2 10,000 τ 2 71,000 γ 2 52,000 Se requiere para la union de DnaB Unión estable al molde, dimerización del núcleo Núcleo de la polimerasa δ 1 35,000 δ 1 33,000 χ 1 15,000 Abrazadera que carga las subunidades β al DNA ψ 1 12,000 β 4 37,000 Pinzas que forman una rueda sobre el DNA y aseguran óptima procesividad

43 Abrazadera complejo γ proteínas β Pinza rodante

44 La DNA pol III es altamente procesiva gracias a las subunidades β

45 Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli Sub # por holoenzima Mr Función α 2 132,000 Actividad polimerasa ε 2 27,000 Exonucleasa 3 5 θ 2 10,000 τ 2 71,000 γ 2 52,000 Se requiere para la union de DnaB Unión estable al molde, dimerización del núcleo Núcleo de la polimerasa δ 1 35,000 δ 1 33,000 χ 1 15,000 Abrazadera que carga las subunidades β al DNA ψ 1 12,000 β 4 37,000 Pinzas que forman una rueda sobre el DNA y aseguran óptima procesividad

46 Modelo del dímero

47 Función n en la horquilla de replicación

48 La DNA pol III es la que replica las dos hebras a la vez Corrige errores con actividad exonucleasa 3 5 La replicación de la hebra retrasada se interrumpe cada 1000 nt approx

49 DNA polimerasa I La DNA pol I rellena los espacios entre fragmentos de Okazaki Utiliza actividad exonucleasa 5 3 para eliminar cebador de RNA

50 Función de la DNA polimerasa I en la replicación

51 Función de la DNA ligasa en la replicación 1. Formación del intermediario Enzima ATP 2. Transferencia del adenilo al 5 -P 3. Formación del enlace fosfodiéster La DNA ligasa de E. coli es una enzima de 75 kda. Es muy lábil

52 TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN EN PROCARIONTES Las dos horquillas de replicación se aproximan a la misma región que contiene las cajas Ter. Son secuencias de 22 pb, tambien llamados sitios de terminación. Están presentes en tandem (seis) en forma invertida. A estas secuencias se unen las proteínas TUS (TBP). La presencia de estas proteínas de unión a DNA causa que se detenga el avance de las horquillas. Tus: termination utilization substance TBP: Termination binding protein. Proteína de 36 kda que afecta la actividad de la DNA helicasa (DnaB).

53 TERMINACIÓN. Desenrrollamiento y Síntesis reparativa. Las dos hebras duplex, productos de la replicación están enrrolladas La topoisomerasa IV contribuye a la desnaturalización y descatenación de las hebras. Mutantes en el gene de TopoIV exhiben cromosomas que no se han separado totalmente. Ocurre síntesis reparativa para llenar los huecos

54 Cadena lider DNA pol III Dna B Topoisomerasa Helicasa RNA Primasa Cadena retrasada Cebador DNA pol III Fragmentos de okasaki SSB

55 Cómo se asegura la célula que su DNA se replica solo una vez?

56 Las enzimas Dam metilasas regulan el inicio en el origen de replicación

57 Los cromosomas eucariontes tienen múltiples origenes de replicación

58 No todos los orígenes de replicación se activan al mismo tiempo

59 REPLICACIÓN DE DNA EN EUCARIONTES En eucariontes, la replicación comienza en muchos sitios a lo largo de los cromosomas.

60 Los orígenes de replicación de metazoarios no están definidos por una secuencia específica, como el oric. Sino que consisten en: Sitios de inicio de alta frecuencia Sitios de inicio de baja frecuencia Los orígenes de replicación se establecen durante la fase G 1 del ciclo celular y dependen de mucho parámetros: Estructura nuclear Secuencia de DNA Estructura de la cromatina Modificaciones en el DNA Permite modificar el número y localización de los orígenes de replicación

61 DNA polimerasas en células eucariotas

62 Proliferating-Cell Nuclear Antigen (PCNA) PCNA es una proteína de 29 kda. Forma un trímero alrededor del DNA. Incrementa la procesividad de la DNA pol delta hasta 40 veces. Se ha demostrado su interacción in vitro con mas de 50 proteínas. Entre ellas: Ciclina D1, cdk2 y el inhibidor de cdks

63 Replicación del ADN: en E. coli vs. en células humanas E. coli Cél humanas Cantidad de DNA, pb/ cél Velocidad avance horquilla µm/min 30 3 Velocidad de replicación, nt / seg Número de orígenes de replicación / célula Tiempo 1 replicación genómica (hs) Tiempo 1 división celular (hs)

64 Los orígenes de replicación más estudiados son de levadura

65 Origen de replicación en eucariotas Complejo prereplicativo

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67 TERMINACIÓN EN EUCARIONTES El dilema de los cromosomas lineales Durante la terminación en procariontes, hay hidrólisis del cebador pero el extremo 3 de la cadena funciona para cebar la síntesis que así completa la cadena. Sin embargo, en los cromosomas lineales de eucariontes, después de eliminar al cebador no hay forma de completar la síntesis. Esto implica que los cromosomas se irían acortando después de cada ronda de duplicación

68 TERMINACIÓN EN EUCARIONTES El dilema de los cromosomas lineales. La Solución Telomerasa. Enzima que adiciona secuencias cortas que se repiten en los extremos de los cromosomas. Telómeros. Las secuencias repetidas varían entre especies: Tetrahymena Humano Paramecium Trypanosoma Arabidopsis TTGGGG TTAGGG TTGGGG TTAGGG TTTAGG

69 La telomerasa es una DNA polimerasa que utiliza RNA como molde La telomerasa está compuesta por dos subunidades: Subunidad catalítica (proteína) Subunidad de RNA asociada Funciona como molde para elongación de una de las cadenas.

70 Mecanismo de acción de la telomerasa

71 Mecanismo de acción de la telomerasa

72 El resultado: La telomerasa está presente en células embrionarias, pero en células somáticas su actividad es muy baja.

73 Topología del DNA Tiene implicaciones en los procesos de Replicación, Recombinación y Reparación

74 La replicación causa superenrollamiento

75 La replicación causa superenrollamiento DNA duplex parental relajado DNA circular Replicación Región superenrollada

76 Las proteínas DnaB y DNA Girasa resuelven el problema Proteína DnaB DNA Girasa

77 Las topoisomerasas

78 Las topoisomerasas Tipo I cortan 1 sola hebra

79 Las topoisomerasas Tipo II cortan las 2 hebras Topoisomerasa IV Girasa

80 Topoisomerasa IV participa en la terminación de la replicación de moléculas circulares.

81 Decatenación

82 Topoisomerasa I Acción de las Topoisomerasas durante la recombinación

83 En Eucariotes, durante la replicación hay modificaciones en los octámeros de histona

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85 Las Histonas parentales se distribuyen proporcionalmente entre las nuevas cadenas.

86 El patrón de nucleosomas se hereda a las cadenas hijas