NMP PARA LA DETERMINACION DE COLIFORMESY COLIFORMES FECALES EN AGUAS

Transcripción

1 PRT Página 1 de 6 1. OBJETIVO Este método es utilizado para estimar la densidad de bacterias del grupo coliformes y conocer la calidad sanitaria en aguas crudas 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Este procedimiento se aplica a aguas crudas y agua de mar 3. FUNDAMENTO Los métodos utilizados en la determinación de E. coli, coliformes totales y coliformes fecales como microorganismos indicadores de la calidad sanitaria de agua, se basan en la fermentación de la lactosa. El método de número más probable NMP, es un método estadístico, compuesto por una etapa presuntiva y confirmativa. El ensayo consiste en sembrar diluciones seriadas de la muestra en medios líquidos. Basándose en la combinación de tubos positivos se puede estimar el número de microorganismos presentes con el uso de la tabla estadística aportada por la referencia 4. REFERENCIAS 4.1 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21 ª Ed Capítulo B y 9221 E.1 página 9-49, 9-50 y TERMINOLOGÍA 5.1 Grupo coliformes El grupo coliformes incluye bacilos gram negativos, aeróbios y anaeróbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando ácido y gas dentro de 48 hrs.a 35ºC. Este grupo incluye a los géneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter. 5.2 Grupo coliformes fecales Coliformes fecales se definen como bacilos gram negativos aeróbios y anaeróbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando ácido y gas dentro de 24 hrs. a 44,5 ± 0,2ºC. En la actualidad se utiliza el grupo coliformes fecales, especialmente para calificar sanitariamente la calidad del agua.

2 PRT Página 2 de 6 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 EQUIPOS Incubadora a 35º ± 0,5ºC Baño de agua termorregulado con agitación a 44,5º ± 0,2º C Termómetros calibrados con graduaciones de 0,1ºC 6.2 CEPAS CONTROL Control positivo :cepa de Escherichia coli ATCC Control negativo :cepa de Staphylococcus aureus. ATCC Control negativo coliformes fecales: cepa Enterobacter aerogenes ATCC MATERIALES Pipetas graduadas de 1, 5 y Tubos o botellas de dilución, de vidrio borosilicato con tapas herméticas Tubos de fermentación de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm Asa de 3 mm de diámetro Propipeta 6.4 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST) doble concentración (10 ml) distribuidos en tubos con tapa caps de 18x180mm o 16x160mm Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST) concentración simple (10 ml) distribuidos en tubos con tapa caps de 18x180 ó 16x 160mm Caldo Bilis Verde Brillante 2% (BVB) Caldo EC Agua peptonada 10 % o agua de dilución buffer fosfato Butterfield s con MgCl 2.

3 PRT Página 3 de 6 7. DESARROLLO 7.1 TEST PRESUNTIVO En el test Presuntivo se utiliza caldo LST con tubos de fermentación y como diluyente, agua de dilución buffer fosfato Butterfield s estéril Previo a la inoculación, la muestra y diluciones, deben agitarse vigorosamente 25 veces. Mezclar por agitación suave las porciones de muestra en el medio Inocular 5 tubos de caldo LST doble concentración con 10 ml de muestra cada tubo Inocular 5 tubos de caldo LST concentración simple con 1 ml de muestra cada tubo Transferir 1 ml de muestra a un tubo que contenga 9 ml de diluyente para obtener la dilución 1: Inocular 5 tubos de caldo LST concentración simple con 1 ml de la dilución 1: Transferir 1 ml de muestra en dilución 1:10 a un tubo que contenga 9 ml de diluyente para obtener la dilución 1: Inocular 5 tubos de caldo LST concentración simple con 1 ml de la dilución 1: Incluir como control positivo una cepa de Escherichia coli y como control negativo una cepa de Staphylococcus aureus. Incluir tubos de medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios de cultivo y placas Petri abiertas y cerradas para control de ambiente Agitar la gradilla suavemente para mezclar la muestra y el medio de cultivo e incubar los tubos inoculados a 35º ± 0,5º C y observar la formación de gas en cada tubo a las 24 ± 2 hrs Transferir todos los tubos que resulten positivos, para realizar el test confirmativo. Los tubos que no presentan gas, se incuban nuevamente y se observa la formación de gas a las 48 ± 3 hrs., y se transfieren si resultan positivos Anotar la presencia o ausencia de gas en cada tubo en el registro RG La formación de gas se reconoce por la aparición de burbujas en la campana Durham y significa un test presuntivo positivo para coliformes. La ausencia de gas al término de 48 ± 3 hrs de incubación, significa un test presuntivo negativo para coliformes. Anotar los cultivos control en el registro RG , el control de esterilidad de los medios en el registro RG y los controles ambiente en el registro RG

4 PRT Página 4 de TEST CONFIRMATIVO PARA COLIFORMES Y COLIFORMES FECALES Todos los tubos de fermentación del test Presuntivo, que muestren formación de gas al término de las 24 o 48 hrs. de incubación deben someterse a las pruebas confirmativas. Cuando aparece una activa fermentación en los tubos, antes de completar el período de 24 hrs., es aconsejable transferirlos sin esperar el tiempo total de incubación Mezclar el tubo de fermentación del test presuntivo por agitación suave y transferir con un asa de 3 mm. de diámetro o un stick de madera, un inóculo de cultivo viable a tubos de caldo EC conteniendo tubos de fermentación. Colocar los tubos EC en el baño termorregulado dentro de 30 minutos después de la inoculación Simultáneamente transferir una asada de cultivo a tubos de fermentación conteniendo caldo BVB para confirmar coliformes. Cuando se transfiere con asa, se deben tener las precauciones de: inocular primero el caldo EC y luego el caldo BVB y de enfriar bien el asa para transferir un inóculo de cultivo viable. Incluir un tubo de caldo bilis verde brillante con una cepa de Escherichia coli como control positivo y otro con una cepa de Staphylococcus aureus como control negativo Incubar los tubos de caldo EC inoculados, en un baño de agua cubierto a 44,5º ± 0,2º C por 24 ± 2 hrs. El nivel de agua en el baño debe sobrepasar el nivel de caldo dentro de los tubos Incluir un tubo de caldo EC con una cepa de Escherichia coli como control positivo de y otro con una cepa de cepa Enterobacter aerogenes como control negativo Los tubos de caldo BVB inoculados se incuban a 35º ± 0,5º C, por 24 a 48 horas Observar la formación de gas en los tubos de caldo EC y los tubos de caldo BVB, al término de los períodos de incubación correspondientes. La presencia de gas en los tubos de fermentación de caldo BVB, significa un test positivo para coliformes, ausencia de gas indica test negativo. La presencia de gas en los tubos de fermentación de caldo EC, significa un test positivo para coliformes fecales, ausencia de gas indica test negativo Anotar los resultados de las muestras en el registro RG y de las cepas control en el registro RG y RG

5 PRT Página 5 de CALCULO La combinación de tubos positivos obtenidos se refiere a la Tabla NMP, y los resultados se expresan como NMP por 100 de muestra Si en vez de las porciones de muestra de ,1, se utiliza 1-0,1-0,01, se lee el resultado en la Tabla NMP y se multiplica por 10, y si las porciones de muestra son 0,1-0,01-0,001, el resultado de la Tabla NMP se multiplica por 100 y así sucesivamente si se utilizan diluciones más altas Cuando se utilizan más de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de 3 series, eligiendo la dilución más alta que da resultados positivos en los 5 tubos ensayados y las dos diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer en la Tabla de NMP (Ver Ejemplos) Ejemplos de determinación de NMP en series de 5 tubos Ejemplo Cantidad muestra (.) Lectura NMP ,1 0,01 0,001 a 5/5 5/5 5/5 2/5 0/ b 5/5 5/5 4/5 2/5 0/ c 0/5 1/5 0/5 0/5 0/ ,8 2 d 5/5 5/5 3/5 1/5 1/ e 5/5 5/5 5/5 3/5 2/ f 5/5 5/5 5/5 5/5 0/ g 0/5 0/5 0/ < 1,8 < 2 h 5/5 5/5 5/5 5/5 5/ > Número de tubos positivos / número de tubos inoculados

6 PRT Página 6 de EXPRESION DE RESULTADOS Los resultados se expresan como NMP/100 ml de muestra. 8. REGISTROS 8.1 Registro cepas control de incubadoras 8.2 Registro cepas control de baños de agua para análisis de coliformes fecales 8.3 Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli 8.4 Registro control de ambiente laboratorio Enterobacterias 8.5 Registro de resultados análisis de coliformes y coliformes fecales en muestras de agua. 9. ANEXOS No Aplica