TOXOPLASMA IgM EIA WELL REF K1TM. Español. M48.es Rev /2006
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- Juan Luis Tebar Rey
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1 0123 TOXOPLASMA IgM EIA WELL REF K1TM 96 Español M48.es Rev /2006
2 REACTIVOS DEL KIT REACTIVOS CANTIDAD ESTADO FÍSICO MTP 1 x 96 Listo para usar WASH 1 x 50 ml Concentrada DIL 1 x 100 ml Listo para usar NEG 1 x 2 ml Listo para usar POS 1 x 2 ml Listo para usar C/O 1 x 2.5 ml Listo para usar Ag 7 x 2.5 ml Liofilizado CONJ BIO 1 x 19 ml Listo para usar CONJ 1 x 14 ml Listo para usar TMB 2 x 15 ml Listo para usar STOP 1 x 14 ml Listo para usar M48.es - Rev /2006 Pag. 2 /12
3 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LOS ANTICUERPOS IgM ANTI-TOXOPLASMA EN EL SUERO O PLASMA HUMANO PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO 1. APLICACIONES CLÍNICAS El protozoo Toxoplasma gondii es un parásito endocelular que provoca infecciones tanto en el hombre como en los animales. Los huespedes primarios son los gatos, en el intestino de los cuales los protozoos pasan por el estadio sexual de su ciclo de vida. En el hombre la toxoplasmosis es una infección bastante común. La infección se debe principalmente al consumo de carne contaminada cruda o poco hecha, o al contacto con animales infectados, como los gatos. La mayor parte de las infecciones, tanto en los adultos como en los adolescentes, tiene un desarrollo subclínico o muy benigno, a menudo acompañado de linfoadenopatía y ocasionalmente de otros síntomas como fiebre, linfocitosis y mialgia. La corioretinitis es una manifestación bien conocida de la infección, pero puede también tratarse de una recaída retardada de una infección congénita. Las encefalitis debidas a Toxoplasmosis son comunes en pacientes afectados por el SIDA. Los sujetos más vulnerables a la infección por Toxoplasma gondii son los pacientes inmunodeprimidos y el feto, especialmente en el primer semestre del embarazo; durante este periodo en el cual el SNC está en fase de desarrollo, el curso de la enfermedad tiene generalmente un resultado negativo. Las infecciones congénitas son a menudo la causa de abortos, corioretinitis, calcificaciones intracerebrales, problemas psicomotores, hidrocefalia y microcefalia. El título de anticuerpos en la población adulta es variable, dependiendo de varios factores como la edad, área geográfica y método del ensayo. Por ejemplo está bien documentado que el porcentaje de sueros positivos entre los Esquimales es cero, mientras entre los Brasileños es el 72% de la población. La frecuencia de la enfermedad en la población joven de los Estados Unidos oscila entre el 10% y el 20% y entre el 35% y el 70% entre las personas de más edad. La incidencia anual de nuevas infecciones en la población adulta esta comprendida entre el %. 2. PRINCIPIO DEL MÉTODO El presente kit se basa en el método inmunoenzimático(elisa) y más precisamente es un método inmuenozimático de tipo captura para la determinación cualitativa de las IgM específicas anti-toxoplasma. Durante la primera incubación los anticuerpos anti- Toxoplasma de clase IgM eventualmente presentes en el suero, son capturados por los anticuerpos anti cadenas µ de las IgM humanas, adheridos a la superficie de los pocillos. El material que no se haya unido se elimina mediante lavado. En dos sucesivas incubaciones se hace reaccionar una mezcla de antígeno Toxoplasma-anticuerpo monoclonal anti-toxoplasma biotilinado y streptavidina-hrpo con el complejo ya formado entre IgM específicas anti-toxoplasma y anticuerpos anti cadenas µ. Tras un nuevo lavado se añade la tetrametilbencidina (TMB) incolora que, al reaccionar con la peroxidasa presente, produce un compuesto coloreado. La reacción de desarrollo de color se para añadiendo H 2 SO 4 y la intensidad del color, medida en un espectrofotómetro a 450 nm y a 405 nm, es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos IgM anti-toxoplasma presentes en las muestras y controles. 3. REACTIVOS SUMINISTRADOS CON EL KIT: PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD Los reactivos son suficientes para 96 pocillos. El kit debe conservarse a 2-8 C. La fecha de caducidad de cada reactivo está indicada en su etiqueta. M48.es - Rev /2006 Pag. 3 /12
4 Una vez abierto el kit es estable 2 meses a 2-8 C. 3.1 Reactivos específicos MTP Microplaca sensibilizada: 1 microplaca de 96 pocillos divisibles individualmente, sensibilizados con anticuerpo monoclonal anti-igm humanas. Los pocillos no utilizados deben conservarse a 2-8 C en la bolsa de plástico suministrada, cerrada herméticamente. POS Control Positivo: 1 vial (2 ml) de matriz sérica reactiva para IgM anti- Toxoplasma. Conservante: NaN 3 (<0,1%). Listo para usar. C/O Control Cut-off: 1 vial (2.5 ml) de matriz sérica reactiva para IgM anti- Toxoplasma. Conservante: NaN 3 (<0,1%). Listo para usar y coloreado de azul. Ag Antígeno Toxoplasma: 7 viales con Antígeno Toxoplasma inactivado, liofilizados. Antes de usar reconstituya cada vial con 2.5 ml de conjugado biotilinado. El reactivo es estable 10 días a 2-8 C. CONJ BIO Conjugado Biotilinado: 1 vial (19 ml) de anticuerpo monoclonal anti- Toxoplasma conjugado con biotina. Conservante: Neomicina. Listo para usar. CONJ Conjugado Enzimático: 1 vial (14 ml) de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRPO) en matriz sérica y estabilizantes. Conservante: Neomicina. Listo para usar. 3.2 Reactivos comunes para los kits de las líneas: To.R.C.H. E.T.S. y Enfermedades de la infancia WASH Solución de Lavado (concentrada): 1 vial (50 ml) de PBS-Tween 20. Conservante: Mertiolato (<0.05%). Antes de usar diluya la cantidad necesaria: 1:20 con H 2 O destilada. Si se observan cristales insolubles, resuspénderlos poniendo el vial a 37 C durante algunos minutos. Tras la dilución el tampón de lavado es estable 30 días a 2-8 C. DIL Diluyente de las Muestras: 1 vial (100 ml) de matriz sérica y estabilizantes. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Listo para usar y coloreado de rojo. NEG Control Negativo: 1 vial (2 ml) de matriz sérica no reactiva a las IgM anti- Toxoplasma. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Listo para usar y coloreado de rojo. TMB Cromógeno: 2 viales (15 ml) de Tetrametilbencidina (TMB) en tampón de citrato-fosfato, DMSO y H 2 O 2.. Listo para usar. STOP Reactivo de Parada: 1 vial (14 ml) de H 2 SO 4 1N. Listo para usar. CPA Cubreplaca adhesivo. Bolsa de plástico con cierre. 4. MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO 4.1 Ensayo manual Micropipetas automáticas con puntas desechables de volumen variable. Incubador a 37±2 C. Cilindros graduados para la dilución de los reactivos. Bomba de aspiración o instrumento automático de lavado de microplaca. Espectrofotómetro de precisión para microplacas, capaz de medir la absorbancia en el intervalo A, con una longitud de onda de 450 y 405 nm. H 2 O destilada. M48.es - Rev /2006 Pag. 4 /12
5 4.2 Ensayo automático El kit puede utilizarse con instrumentación automática para kits ELISA en microplaca. Se garantiza la aplicabilidad en instrumentación RADIM y/o SEAC. En el caso se utilice instrumentación automática de otros fabricantes, es responsabilidad del usuario asegurarse de que el kit haya sido oportunamente validado. 5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para conseguir resultados correctos y reproducibles, deberán observarse las siguientes normas: No mezclar los reactivos específicos (vea 3.1) de lotes diferentes. Es posible utilizar reactivos comunes (vea 3.2) de lotes diferentes. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. No exponer los reactivos y las muestras al calor intenso ni a fuentes importantes de contaminación. Utilizar material de vidrio perfectamente limpio y libre de contaminación por iones metálicos o sustancias oxidantes. Utilizar agua destilada o desionizada, conservada en recipientes perfectamente limpios. Evitar cuidadosamente la contaminación entre muestras; para ello es aconsejable utilizar pipetas con puntas desechables para cada muestra y reactivo. No modificar el Procedimiento Operativo de ejecución del ensayo. Eventuales alteraciones de: secuencia y cantidades al añadir los reactivos tiempos y temperatura de incubación pueden dar lugar a resultados clínicos erróneos. Reconstituir los reactivos liofilizados según la modalidad descrita en la etiqueta; la utilización de reactivos o volúmenes no adecuados puede provocar la obtención de datos clínicos incorrectos. En el caso de procedimiento manual es importante utilizar pipetas calibradas y tener una adecuada manualidad técnica. En particular es importante la precisión en la preparación y dispensación de los reactivos. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos. Asegurarse de que la bomba de aspiración o el sistema automático para el lavado de las microplacas funcione correctamente. El lavado inadecuado de las microplacas puede causar la clasificación incorrecta de las muestras. Es necesario un mantenimiento adecuado de tales sistemas. Asegurarse de que el espectrofotómetro funcione perfectamente. El uso de un espectrofotómetro no calibrado o con filtros no limpios puede causar una lectura errónea de las muestras, con consiguiente error en su clasificación. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos. Asegurarse de que el incubador (si es necesario) funcione perfectamente. La incubación a temperaturas distintas a los 37±2º puede causar una pérdida de sensibilidad y/o desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos y un control periódico de la temperatura registrada. Asegurarse de que el agitador de microplacas (si es necesario) funcione perfectamente. La agitación incorrecta puede causar la clasificación errónea de las muestras. Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos. Asegurarse de que los sistemas utilizados para la conservación de las muestras y/o el dispositivo funcione perfectamente. La conservación a temperaturas diferentes de la indicada puede causar la desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o M48.es - Rev /2006 Pag. 5 /12
6 reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales sistemas y un control periódico de la temperatura registrada. Utilizar un método adecuado para la correcta identificación de las muestras de los pacientes. Una identificación incorrecta puede provocar pérdida de la especificidad del sistema y resultados clínicos erróneos. Para evitar contaminaciones personales y ambientales, deberán observarse las siguientes normas de seguridad: Utilizar guantes desechables durante la manipulación del material potencialmente infeccioso y durante el ensayo. No pipetear los reactivos con la boca. No fumar, comer, beber o aplicar cosméticos durante la ejecución del ensayo. Las soluciones de Cromógeno y el Reactivo de Parada deben manipularse con cuidado. Evitar el contacto con la piel, los ojos y las mucosas. En caso de contaco lavar con abundante agua. Todos los materiales humanos suministrados con el kit han sido sometidos a análisis resultando negativos a la presencia de HBsAg, anti-hiv y anti-hcv. Sin embargo, los ensayos mencionados no garantizan la total ausencia de los agentes vírales responsables del síndrome de inmunodeficiencia adquirida y de la hepatitis B y C. Por eso todos los reactivos contenentes material biológico y todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosos. Evitar salpicaduras y formación de aerosoles; en caso de que se presenten, limpiar cuidadosamente con hipoclorito sódico a una concentración final de 3%. Todo el material utilizado para la limpieza debe tratarse como residuo potencialmente infeccioso y desecharse según las oportunas modalidades. La azida sódica, contenida como conservante en algunos reactivos, puede reaccionar con el plomo y el cobre de los desagües formando azidas metálicas altamente explosivas. Para evitar la formación y la acumulación de dichos compuestos deje correr abundantemente el agua al eliminar los reactivos. Los reactivos para los que no se suministra la ficha de seguridad no contienen sustancias químicas peligrosas o, si las contienen, están por debajo de los límites de concentración definidos en el D.Lgs.285/98 conforme a la directiva CEE 91/155. Conforme al Decreto Italiano D.L. no. 22, del y conforme a las directivas de la CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE), todos los desechos originados por procesos manuales y/o automáticos se clasifican como material de deshecho peligroso, código de Clasificación CER : como tales, deben eliminarse delegando su recolección y desecho a empresas especiales autorizadas para ello. 6. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS El ensayo puede realizarse en muestras de suero o plasma humanos. Las muestras moderadamente lipémicas no afectan los resultados; las muestras extremadamente lipémicas o hemolizadas pueden alterar los resultados. La presencia de filamentos de fibrina podría interferir en el ensayo; asegúrese por lo tanto de que las muestras estén perfectamente limpias antes de ensayarlas. Las muestras pueden conservarse a 2-8 C durante 1-2 días; para períodos más largos se recomienda conservar las muestras a - 20 C. Evite congelar y descongelar repetidamente las muestras. Antes de su uso, diluya las muestras 1:100 con diluyente de las muestras (ejemplo: 10 µl de muestra µl de diluyente). 7. PROCEDIMIENTO OPERATIVO Deje que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente. Agite las muestras por inversión antes de utilizarlas. M48.es - Rev /2006 Pag. 6 /12
7 7.1 Prepare los pocillos en duplicado para los Sueros de Control e individual para el Blanco y las Muestras. 7.2 Dispense 100 µl de Sueros de Control y Muestras ya diluidas, en los respectivos pocillos. Nota: No diluya los sueros de control. 7.3 Dispense 100 µl de diluyente de las muestras en el pocillo del blanco. 7.4 Incube durante 60±5 minutos a 37±2 C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva suministrada con el kit. 7.5 Lave los pocillos 4 veces con 350 µl (por pocillo) de solución de lavado diluida. Aspire completamente el líquido de todos los pocillos. 7.6 Dispense 100 µl de Antígeno reconstituido con el Conjugado Biotilinado en todos los pocillos. 7.7 Incube durante 60±5 minutos a 37±2 C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva suministrada con el kit. 7.8 Lave los pocillos como en el punto Dispense 100 µl de Conjugado Enzimático en todos los pocillos Incube durante 30±2 minutos a 37±2 C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva suministrada con el kit Lave los pocillos como en el punto Dispense 100 µl de Cromógeno en todos los posillos Incube durante 10 minutos a 37±2 C o 15 minutos a temperatura ambiente (18-25 C), al resguardo de la luz Dispense 100 µl de solución de parada en todos los pocillos Lea la densidad óptica a 450 nm, preferiblemente en un espectrofotómetro bicromático con longitud de onda de referencia de 620 nm (haciendo el cero del instrumento con el blanco). En el caso de lectura fuera del rango (overflow), lea a 405 nm. Lea en los primeros 15 minutos después de terminar el ensayo. *Si en el procedimiento se utiliza instrumentación automática RADIM y/o SEAC para microplacas, vea el manual correspondiente. 8. ESQUEMA DEL ENSAYO: Vea pág CÁLCULO DE LOS RESULTADOS * Se deberá considerar la densidad óptica de cada uno de los controles negativo, positivo y Cut-off. Comparando la densidad óptica de las muestras con la densidad óptica del control Cut-off (valor umbral) se determina la reactividad o no reactividad ante los anticuerpos IgM anti-toxoplasma gondii. Las muestras con valores de densidad óptica inferiores al valor del control Cut-off deben considerarse no reactivas para los anticuerpos IgM anti-toxoplasma. Las muestras con valores de densidad óptica superiores al valor del control Cut-off deben considerarse reactivas para los anticuerpos IgM anti-toxoplasma. Las muestras con valores de densidad óptica comprendidos en el intervalo de ± 10% del control Cut-off, deben considerarse de interpretación dudosas y deben volverse a ensayar. * En el caso de que se utilice el sistema automático RADIM y/o SEAC para microplacas, la lectura espectrofotométrica se realiza automáticamente con 3 longitudes de onda: 450, 405 y 620 nm, permitiendo la ampliación del rango de lectura. M48.es - Rev /2006 Pag. 7 /12
8 9.1 Ejemplo de cálculo Los valores siguientes deben considerarse únicamente como un ejemplo y no deben emplearse en lugar de los datos experimentales. Descripción D.O. 450 nm Control Negativo Control Cut-Off Control Positivo Muestra La muestra ensayada resulta positiva para los anticuerpos IgM anti-toxoplasma. 9.2 Criterios de aceptación Antes de proceder al cálculo de los resultados, verifique que las absorbancias de los controles respeten los siguientes valores: Descripción Valor esperado Control Negativo <0.200 Control Positivo >0.700 Si los valores obtenidos no son los esperados, será necesario repetir el ensayo. 9.3 Interpretación de los resultados Las muestras no reactivas deben considerarse negativas a la presencia de anticuerpos IgM anti-toxoplasma. Las muestras reactivas deben considerarse positivas a la presencia de anticuerpos IgM anti-toxoplasma. Las muestras de interpretación dudosa deben ensayarse nuevamente para confirmación. 10. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS 10.1 Especificidad diagnóstica La especificidad diagnóstica del método se ha evaluado en un grupo de 183 muestras negativas al IgM anti-toxoplasma, resultando igual al 98.2% Sensibilidad diagnóstica La sensibilidad diagnóstica del método se ha evaluado en un grupo de 124 muestras con infección aguda de Toxoplasma, resultando igual al 98.1% Especificidad analítica La especificidad analítica se define como la capacidad del ensayo de detectar con precisión el analito en presencia de factores potencialmente interferentes en la matriz de la muestra. Estudios controlados sobre factores potencialmente interferentes han demostrado que las prestaciones del ensayo no se influencian por anticoagulantes (EDTA y heparina). M48.es - Rev /2006 Pag. 8 /12
9 10.4 Precisión La precisión se ha evaluado en instrumentación Radim midiendo la repetitividad y la reproducibilidad (variabilidad intra-ensayo e inter-ensayo) en 3 sueros con distintas concentraciones de IgM anti-toxoplasma. Repetitividad (intra-ensayo) Suero Media ± D.E. C.V. No. de Replicados (S/CO) % a 4.46 ± b 1.73 ± c 0.96 ± Reproducibilidad (inter-ensayo) Suero Media ± D.E. C.V. No. de Ensayos (S/CO) % a 1.72 ± b 5.41 ± c 1.40 ± LÍMITES DEL ENSAYO Debe tenerse en cuenta que, para definir el estado inmunitario de un paciente ante el Toxoplasma gondii, la presencia de los anticuerpos de clase IgG a cualquier nivel no excluye la posibilidad de una infección en curso, mientras que el ensayo de los anticuerpos específicos de tipo IgM son de importancia fundamental para el diagnóstico precoz de la infección aguda. En caso de infección en curso, una intervención rápida permite reducir considerablemente los riesgos consiguientes. El empleo del método inmunoenzimático de captura evita posibles resultados no específicos. Sin embargo, los resultados del ensayo deben interpretarse con cautela y convalidarse con evaluaciones clínicas y ulteriores diagnósticos. 12. LEYENDA SÍMBOLOS: Vea pág. 10 M48.es - Rev /2006 Pag. 9 /12
10 SÍMBOLOS EN 980 EDMA REF Código de referencia o número de pedido LOT Lote Fecha de caducidad IVD Para uso diagnóstico in-vitro Marcado CE según directiva de IVD 98/79 CE Conserve a 2-8 C Producido por Riesgo biológico Consulte las instrucciones de uso 96 Suficiente para 96 determinaciones RDATE Fecha de referencia RCNS Reconstituya con H 2 O Agua destilada o desionizada M48.es - Rev /2006 Pag. 10 /12
11 BIBLIOGRAFÍA 1 - Remington J.S. (1974). Toxoplasmosis in the adult. Bull N.Y. Acad. Med. 50, Vilaseca J. et al. (1982). Kaposi's sarcoma and T. gondii brain abscess in Spanish homosexual. Lancet No. 8271, Vol. 1, Feldman H.A. (1982). Epidemiology of Toxoplasma infections. Epidem. Rev., 4, Milatavic D., Braveny I. (1980). Enzyme-liked immunosorbent assay for the serodiagnosis of toxoplasmosis. J. Clin. Pathol. Vol. 33, Van Loon Am A., Van der Veen (1980). Enzyme-linked Immunosorbentassay for quantitation of toxoplasma antibodies in human sera. J. Clin. Pathol. Vol.33, M48.es - Rev /2006 Pag. 11 /12
12 ESQUEMA DEL ENSAYO Predilución de la muestra: 1/100 Reactivos Pocillos Blanco NEG POS C/O Muestras NEG µl POS 100 µl C/O 100 µl Muestras µl DIL 100 µl Incube a 37±2 C, 60±5 min. Aspire y Lave: 4 x 350 µl. Ag CONJ BIO Incube a 37±2 C, 60±5 min. Aspire y Lave: 4 x 350 µl. 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl CONJ 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incube a 37±2 C, 30±2 min. Aspire y Lave: 4 x 350 µl TMB 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incube a 37±2 C, 10' o a T.A. 15' STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Lea a nm. RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.it -
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