HPLC CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA CLÁSICA HPLC. Lentitutd Operación manual

Transcripción

1 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA CLÁSICA Lentitutd Operación manual Columnas reutilizables pequeño diámetro. Disminución tamaño partícula f.e. Desarrollo nuevas f.e. Introducción de muestra precisa en pequeñas cantidades. Detectores contínuos, sensible y que trabajan a caudales bajos.

2 Instrumentación fase móvil inyector bomba columna (fase estacionaria) detector sistema de adquisición de datos Instrumentación Eluyentes Sistema de impulsión Sistema de inyección de muestra Columna Detector Sistema de (control y) adquisición de datos

3 Fase móvil Fases móviles Tipos de eluyentes Agua (con o sin sales disueltas) Disolventes La utilización de unos u otros depende del tipo de cromatografía (fase normal, fase inversa, intercambio iónico, etc.) Tipo de elución Isocrática Gradiente (precaución precipitaciones!!) Eliminación de partículas Filtración a través de 0.45 µm Desgasificación Ultrasonidos Burbujeo de helio Vacío (desgasificadores en serie) Algunas recomendaciones: Cambio diario de tampones No dejar las líneas tiempos largos en agua Tampón-Agua-Disolvente orgánico

4 Fase móvil Sistema de impulsión de los eluyentes Exigencias: Presión atm Salida libre de pulsos Caudales entre 0.1 y 10 ml/min Reproducibilidad de caudales Resistencia a la corrosión por los disolventes Bombas: Bomba tipo jeringa impulsada por un tornillo Flujo libre de pulsos Baja capacidad (aprox. 250 ml) No adecuada para cambios de disolvente

5 Fase móvil Sistema de impulsión de los eluyentes Bombas: Bomba aspirante-impelente con doble pistón en serie

6 Fase móvil Sistema de impulsión de los eluyentes (cont.) Forma de mezclar los eluyentes: Mezclado a alta presión (dos bomba de alta presión + programador) Mezclado a baja presión (dos bombas de baja presión o válvula proporcional + programador + una bomba de alta presión)

7 Inyección Sistema de inyección Exigencias: inyección en línea de alta presión baja dispersión de la muestra precisión volúmenes variables automatizable sin memoria Inyector manual con bucle: posición de carga posición de inyección

8 Inyección Sistema de inyección Algunas recomendaciones: Realizar el cambio carga - inyección con decisión. Mantener la jeringa en la puerta de inyección para evitar succiones involuntarias de la muestra al extraer la jeringa. Mantener la válvula en posición inject durante el análisis. Emplear jeringas adecuadas: punta cuadrada GC Es preferible inyectar volúmenes pequeños. Mejor 10 µl de una concentración que 20 µl del doble de concentración

9 Muestra Muestra Disolución libre de partículas (filtración) y miscible con la fase móvil Disolvente soluble en F.M. solución inyección Dilución en F.M. Separación productos insolubles en F.M. Solubles en F.M. Eliminación de posibles interferencias sólido inyección Algunos productos insolubles en F.M.: extracción, eliminación de interferencias, preparación de derivados, etc. Volumen de inyección 20 µl analítica 100 µl HPSEC o semipreparativa Concentración mg/ml

10 Muestra Disolvente para la muestra Idealmente disuelta en fase móvil Si se trata de un gradiente, composición inicial Si no es posible, que tenga la máxima proporción de eluyente acuoso (en fase inversa) posible

11 Fase estacionaria Columnas CROMATOGRAFÍA ULTRARRÁPIDA Longitud: 3-6 cm Diámetro: 0.45 mm Tamaño de partícula: 5-3 µm Caudal: 2 ml/min Tiempos de análisis menores Ahorro de disolventes Mejora cantidad detectable DISMINUIR LONGITUD Y TAMAÑO DE PARTÍCULA CROMATOGRAFÍA CONVENCIONAL Longitud: cm Diámetro: 0.45 mm Tamaño de partícula: 5-10 µm Caudal: 1-2 ml/min DISMINUIR DIÁMETRO Ahorro de disolventes Mejora cantidad detectable CROMATOGRAFÍA MICRO-BORE Longitud: cm Diámetro: mm Tamaño de partícula: 5 µm Caudal: ml/min

12 Fase estacionaria Columnas Narrow-bore

13 Fase estacionaria Columnas Ultrarrápidas

14 Detectores Detectores Absorción UV-VIS Longitud de onda fija (lámpara de Hg) lámpara muestra referencia volumen muerto: 4-12 µl camino óptico: aprox. 1 cm fotodiodos Longitud de onda variable (lampara de D 2 o W) lámpara Red de difracción

15 Detectores Detectores Absorción UV-VIS Red de fotodiodos (DAD-UV):

16 Detectores Detectores Absorción UV-VIS Red de fotodiodos (DAD-UV):selección de λ

17 Detectores Detectores Absorción UV-VIS Red de fotodiodos (DAD-UV):pureza de pico absorbancia cromatograma absorbancia tiempo espectro longitud de onda

18 Detectores Detectores Índice de refracción Fluorescencia: sensibilidad/selectividad Conductimétrico Electroquímico Másico (dispersión de luz) Espectrómetro de masas Detector Estabilidad Selectividad Gradiente? Sensibilidad Absorción UV-VIS Alta Media Sí Variable (alta) Índice de refracción Baja No No 500 ng Fluorescencia Alta Sí Sí Variable (0.1 ng) Conductimétrico Baja Sí No 5 ng Electroquímico Baja Sí Sí? 0.01 ng Másico Media No Sí 50 ng

19 - Fase normal Fase estacionaria: Polar gel de sílice, alúmina, gel de sílice modificado con grupos amino, diol, ciano Fase móvil: Apolar (inferior a la del analito) pentano, ciclohexano, CCl 4, tolueno, CHCl 3, CH 2 Cl 2, THF, dioxano poder elutrópico se incrementa con la polaridad

20 - Fase normal Interacciones analito-fe: Interacciones dipolo-dipolo (permanente o inducido) Interacciones ácido-base Interacciones puente de hidrógeno Compuestos menos polares Compuestos más polares Tiempo de retención Aplicaciones: Compuestos muy apolares Mezclas de productos de polaridad muy diferente Inconvenientes: Fácil desactivación gel de sílice Adsorciones irreversibles (compuestos básicos)

21 - Fase inversa Fase estacionaria: No-polar Sílica modificada con grupos C 2, C 8, C 18 Sílica modificada con grupos fenilo Polímeros orgánicos poco polares (estirenodivinilbenceno) funcionalizados o no

22 - Fase inversa Fase móvil: Polar Agua, metanol, acetonitrilo, THF Mecanismo principal de reparto Compuestos más polares (Mismo tamaño molecular) Compuestos menos polares Menor tamaño (Misma polaridad) Mayor tamaño Tiempo de retención Aplicaciones: Productos de polaridad media-baja Gran versatilidad -FASE INVERSA: LA MÁS UTILIZADA ACTUALMENTE

23 - Fase inversa Compuestos básicos en fase inversa carbendazim thiabendazole Columna C18 no desactivada (150x3.9 mm; 4 µm) Columna C18 desactivada (150x4 mm; 5 µm) desactivado silanol libre Desactivación o end-capping

24 - Fase inversa Separación de naftaleno, bifenilo, fluoreno, fenantreno y antraceno 100% AcN 90% AcN 10% agua 80% AcN 20% agua 70% AcN 30% agua Columna: Licrospher 100 (Merck) RP-18 (125 x 4 mm, 5 µm)

25 Intercambio iónico Fase estacionaria: Sílica o polímeros orgánicos funcionalizados con restos iónicos Intercambiadores catiónicos:re-so 3-, RE-COO - Intercambiadores aniónicos: RE-N + R 3, RE-NR 2 Fase móvil: Disoluciones acuosas de tampones (influye ph, fuerza iónica ) Interacción iónica

26 Intercambio iónico Monovalentes Divalentes Trivalentes Menor radio Mayor radio Tiempo de retención

27 Exclusión molecular Fase estacionaria: Polímeros de estirenodivinilbenceno en forma de gel Fase móvil: Orgánica (THF) o acuosa (agua) Interacción: No hay Separación: Se debe a que las móleculas de menor volumen puedn penetrar en un mayor número de poros que las moléculas de mayor tamaño.

28 Exclusión molecular Mayor peso molecular Menor peso molecular Tiempo de retención