Genética bacteriana I

Transcripción

1 Genética bacteriana I Analista Biológico Técnico Universitario en Esterilización 2015 Genética microbiana qué son los genes cómo se replican cómo se transmite la información a generaciones posteriores o entre microorganismos cómo la expresión de sus información determina las características particulares de un organismo. Qué son las mutaciones 1

2 Cromosoma procariótico Única hebra de DNA bicatenario Haploides Circular y covalentemente cerrado Superenrollamiento negativo Transporta toda la información genética necesaria para todas las estructuras y funciones de la célula E. coli: casi 5000 kpb de DNA No posee envoltura nuclear Cromosoma eucariótico DNA bicatenario lineal Múltiples cromosoma (S. cereviseae: 8 p) Poseen histonas (nucleosoma) Núcleo con envoltura nuclear Diploides Tomado de Brock. Microbiología de los microorganismos. 12 edición Definiciones importantes Gen: unidad de la herencia, segmento de DNA que especifica una proteína, un trna, un rrna o cualquier otro RNA no codificante. Se encuentra en el cromosoma o en plásmidos Es responsable de: - las características estructurales y metabólicas de un organismo - la transmisión de estas características de una generación a otra. Genoma: conjunto total de genes contenidos en una célula ó en un virus Genotipo: descripción completa de la información génica de una célula. Fenotipo: características observables tanto morfológicas como fisiológicas REPLICACIÓN: síntesis de ADN utilizando ADN como molde TRANSCRIPCIÓN: síntesis de ARNm usando ADN como molde TRADUCCIÓN: síntesis de una proteína usando la información genética del ARNm como molde 2

3 Flujo de la información genética Replicación Transcripción Traducción Estructura del ADN ARN ADN 3

4 Superenrollamiento del ADN: El ADN de doble cadena es retorcido aún más. Topoisomerasas clase I: cortan una sola hebra de DNA, elimina el superenrollamiento adicional en el DNA, lo relaja Topoisomerasas clase II (DNAgirasa): cortan ambas hebra de DNA e introduce superenrrollamiento negativo en el DNA. Para evitar que todo el cromosoma bacteriano se relaje cada vez que se realiza una muesca, se organiza en dominios de superenrollamiento, estabilizado por proteínas de unión especificas. Superenrollamiento: para empaquetar el DNA en el interior de la célula Relajación: es necesaria para la replicación y la transcripción. Replicación REPLICACIÓN: síntesis de ADN utilizando ADN como molde 4

5 Replicación Replicación semiconservativa Cadena parental Nueva cadena complementaria Nueva cadena complementaria DNA polimerasas: en procariotas existen 5 polimerasas. La ADN pol sintetiza ADN en dirección 5-3 y añaden nucleótidos a un grupo 3 ya existente. La adición de un nucleótido requiere de un grupo hidroxilo libre en el extremo 3. El 5 -trifosfato de desoxinucleósido se incorpora al 3 hidroxilo de nucleótido anterior La enzima que actúa durante la replicación es la ADN polimerasa III Replicación Origen de la replicación: secuencia especifica de DNA de 250 bases reconocida por proteínas especificas de iniciación. Existe un solo origen de replicación Replicación es bidireccional, dos horquillas de replicación que se mueven en sentidos opuestos, lo que da origen a estructuras theta. 5

6 Replicación Horquilla de replicación: zona de ADN desenrrollado en el que se produce la replicación DNA helicasa: enzima que desenrolla el ADN Proteína de unión a cadena sencilla: estabiliza el DNA monocatenario. La replicación se inicia en las dos cadenas Cadena avanzada: se sintetiza sólo al principio un pequeño cebador de ARN y luego crece de forma continua Cadena retrasada: no hay 3 OH libre, se sintetiza de manera discontinua Cadena retrasada Primasa: sintetiza cebadores de ARN Replicación DNA pol III : añade desoxirribonucleótidos (dntps) hasta alcanzar el DNA sintetizado previamente. DNA pol I: sintetiza DNA, es exonucleasa y que elimina el cebador. DNA ligasa: sella la muesca entre un 5 PO 4 y 3 OH. Fragmentos de Okazaki: fragmentos de ADN y ARN en la cadena retrasada 6

7 Replicación Finalización de la replicación Parada de replicación: las dos horquillas de replicación chocan cuando los dos círculos de DNA están completos. Secuencias Ter reconocidas por proteínas llamada Tus que bloquean el avance Topoisomerasa IV: separa las dos moléculas de DNA entrelazadas para que se divida en cada célula hija Proteína FtsZ: asiste todo el proceso Replisoma Replicación 7

8 Replicación Corrección de errores en la replicación del DNA Pol I y Pol III: poseen actividad exonucleasa que elimina un nucleótido equivocado. Pol I : poseen actividad exonucleasa que elimina el cebador. Replicación Tres métodos generales de replicación: El método θ (theta): dos puntos de crecimiento El método σ (sigma): un punto de crecimiento El método (lineal): varios puntos de crecimiento 8

9 Replicación El método σ (sigma) un punto de crecimiento Replicación por círculo rodante (plásmidos en Gram +, algunos virus y conjugación). La cadena positiva de la forma replicativa es cortada (Proteína A), queda libre el extremo 3 y puede usarse como cebador para la síntesis de una nueva cadena. La rotación continuada del circulo conduce a al síntesis de una estructura lineal de cadena sencilla. La proteína A corta y liga los extremos de la cadena generando una molécula de DNA de cadena sencilla. Velocidad : 45 Kb/min a 37ºC, desenroscar:4500 vueltas /min Transcripción TRANSCRIPCIÓN: síntesis de ARN usando ADN como molde ARN: contiene ribosa y uracilo. Monocatenario ARN mensajero (ARNm): contiene la información para la síntesis de proteínas ARN de transferencia (ARNt): es responsable del transporte específico de aminoácidos a los ribosomas ARN ribosomal (ARNr): componente catalítico y estructural de los ribosomas Subunidad 50S Subunidad 30S Otras clases de RNA: implicados en regulación 9

10 Transcripción En procariotas Transcripción-traducción acopladas Solo se transcribe una de las dos cadenas Ausencia de intrones Expresión génica se regula principalmente en la transcripción. A partir de una molécula de ADN se transcriben muchas moléculas de ARNm diferentes. Operón: grupo de genes relacionados entre sí que se transcriben a la vez para generar un solo ARNm ARNm policistrónico: Un solo ARNm lleva la información de varios genes y se co-transcriben Transcripción RNA polimerasa: necesita un ADN que actúe como molde pero no necesita de cebadores. Holoenzima RNA pol: cinco subunidades Nucleo: sintetiza RNA Factor sigma: reconoce el sitio en el DNA para el comienzo de la síntesis de RNA. 10

11 Inicio de la transcripción Transcripción Promotor: secuencias de ADN específicas a las que se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción. Es reconocida por el factor sigma Secuencias consenso: Se encuentran dentro del promotor, son mas cortas y están altamente conservadas. Estas se sitúan antes del inicio de la transcripción: Región -10: caja Pribnow Región -35: TTGACA Transcripción Factores sigma 11

12 Transcripción Terminación de la transcripción Las repeticiones invertidas en el DNA transcripto forman una estructura tallo bucle que termina la transcripción cuando va seguida de una serie de uracilos Traducción TRADUCCIÓN: síntesis de una proteína usando la información genética del ARN como molde 50S ARNr 5S + ARNr 23S + 31 P 30S ARNr 16S + 21 P Liberación ARNt El ARNt sujeta cadena polipeptídica Ribosoma: lugar de síntesis de proteínas Se une el nuevo ARNt cargado Formados por rrna, proteínas ribosomales y proteínas no ribosómicas. 70S Valor S: unidades de Svedberg, coeficiente de sedimentación 12

13 ARNt: es especifico tanto para el codón como para su aa correspondiente y son puestos en contacto por enzimas especificas: aminoacil-trna-sintetasas Cadena sencilla y estructura secundaria. 73 y 93 nucleótidos de extensión Regiones doble cadena y bases inusuales Parte variable: anticodon Otras partes interaccionan con: rrna, componentes proteicos del ribosoma, proteínas de transducción no ribosómicas y con la aminoacil-trna-sintetasas En el extremo 3 o brazo aceptor tienen tres nucleótidos desapareados: CCA añadidos por la nucleotidil- transferasa terminal. El aa se une covalentemente a la adenosina e incorporado a la cadena polipeptídica. Traducción Traducción Codón: Cada grupo de tres bases de una molécula de ARNm que codifica un solo aminoácido (triplete) Un codón del ARNm es reconocido por el apareamiento específico de sus bases con una secuencia complementaria de tres bases llamada anticodón en los ARNt. 13

14 Traducción Código genético 4 3 : 64 Código degenerado: cada aminoácidos está codificado por más de un codón. Codón de inicio: AUG. Fundamental comenzar en el nucleótido correcto o pauta 0. Codones de parada o codones sin sentido: no codifican ningún aa, indican el final de la traducción: UAA, UAG, UGA La fidelidad del la pauta de lectura correcta depende de las interacciones entre mrna y rrna, y del ribosoma que reconoce un AUG específico en el mrna como codón de inicio con la ayuda de una secuencia situada antes en el mrna: Secuencia de Shine- Dalgarno (3 y 9 nt) Traducción 14

15 Traducción Unión del ARNt con el aminoácido Reconocimiento de los ARNt Una aminoacil-arnt-sintetasa reconoce la secuencia especifica del anticodón y otras regiones importantes del ARNt en el brazo aceptor y el bucle D Activación AA + ATP aminoacil-amp+p-p P-P es escindido por una pirofosfatasa Permanece unido a la sintetasa hasta que choca con el trna Carga aminoacil-amp + trna aminoacil-trna + AMP Finalización El aminoacil-trna abandona la sintetasa y viaja al ribosoma donde se sintetiza el polipéptido. Traducción Iniciación: Se forma el complejo de iniciación: 30S, mrna, trna de formilmetionina, prot. de iniciación y GTP. Luego se añade la subunidad 50S y forma el ribosoma de 70S funcional Sec. de Shine Dalgarno: sec de 3 a 9 nucleóti. antes del codón de inicio del mrna que ayuda a unirlo al ribosoma. Se encuentra en el 5 mrna y es complementario con el 3 del rrna 16S, lo que permite la transducción de mrna policistrónico, por reconocimiento de cada codón de iniciación. Unión de un formilmetionil-trna iniciador al codón de inicio AUG. 15

16 Traducción Elongación: El ARNm se desliza unido a la subunidad 30S. La subunidad 50S interacciona con el ARNt. Ingresa un nuevo ARNt y se une al sitio A (se necesitan factores de elongación/ef) Traslocación: Se produce el enlace peptídico en el sitio A (EF y GTP) y luego el ARNt unido al peptido en crecimiento se trasloca al sitio P (EF y GTP), lo que deja libre el sitio A para otro ARNt cargado. El ribosoma avanza tres nucleótidos y expone un nuevo codón, empujando el trna ahora vacío al Sitio E desde donde es liberado Terminación: cuando el ribosoma alcanza un codón de parada actúan proteínas llamadas factores de liberación que cortan el péptido unido al último ARNt Traducción La traducción de varios ribosomas y un solo mrna: Polisoma. Aumenta la velocidad y eficiencia de la traducción 16

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18 Estabilidad vs evolución mecanismos de reparación = estabilidad génica mecanismos de variabilidad = base de la evolución mutación: modificación heredable en la secuencias de bases de un genoma (pequeños cambios en la célula). La mutación se produce en el ADN. recombinación: intercambio físico de ADN entre elementos genéticos (grandes cambios en la célula) Mutante: portadores de un cambio en su genoma, su fenotipo puede estar alterado o no Cepa salvaje: aislada de la naturaleza. Nomenclatura: gen: hisc prot: HisC fenotipo: His + : capaz de sintetizar su propia histidina. His - : no sintetiza histidina seleccionable: resistencia a los fármacos de los mutantes con respecto a la progenie. Ventaja selectiva al mutante y su aislamiento Mutación no seleccionable: perdida de color de un organismos pigmentado, no tiene ventajas ni desventajas sobre la progenie. Rastreo: examen de un gran numero de colonias). 18

19 Técnica de réplica en placa: para detectar mutantes nutricionales defectivos. La colonia de la placa madre que esta ausente en la placa de réplica (mutante) se puede purificar y caracterizar Una mutante con una necesidad nutricional para el crecimiento: auxótrofo y el progenitor del cual deriva protótrofo (puede ser una cepa salvaje o una mutante) Ej: Los mutantes de E.coli con fenotipo His son auxótrofos de Histidina Causas de mutaciones: Errores en la replicación del DNA Mutágenos: químicos, luz UV o rayos X. Posibles efectos: Sin ningún efecto: mutación silenciosa Producción de una proteína defectuosa o incompleta Producción de una proteína con función disminuida 19

20 Espontáneas: sin intervención humana, radiación natural o radicales de oxígeno. Errores de apareamiento durante la replicación del DNA. Inducidas: con intervención humana. Usadas en ingeniería genética Clasificación de mutaciones sustitución puntuales inserción mutaciones deleción Mutagénesis dirigida: proceso para llevar a cabo mutaciones especificas en el genoma (tecnología de DNA recombinante y DNA sintético) varias bases traslocación inversión por sustituciones - Silenciosa (3 base) - sin sentido - modificadora de función - supresora de función - neutrales De cambio de sentido 1 ó 2 base Sin sentido 3 base 20

21 Sustitución de una base Las inserciones o deleciones afectan el marco de lectura Las mutaciones por desplazamiento en la pauta de lectura provocan cambios mas drásticos en el DNA, a menudo tienen como resultado la pérdida completa de la funcionalidad del gen. 21

22 de varios pares de bases Inversión Inserciones: un trozo de DNA se inserta en un gen. Deleciones : eliminación de un fragmento de un gen Traslocaciones: gran sección de DNA cromosómico se desplaza a una nueva ubicación (reordenaciones por errores en la recombinación) Inversiones: en las que la orientación de un segmento del DNA cambia con respecto al DNA circundante. Frecuencia de mutaciones espontáneas en un gen típico de 1000 pb: 10-6 y 10-9 por generación ó 10-6 y 10-9 Kpb durante un sólo ciclo de replicación. La mutaciones puntuales son, normalmente reversibles, mediante un proceso de reversión. Revertiente: cepa en la que se re-establece el fenotipo original que había cambiado en el mutante Revertientes de un mismo sentido: la mutación que restura la actividad se produce en el mismo sitio que la mutación original. Si la retromutacion no sólo es en el mismo sitio, sino que además restablece la secuencia original: revertiente verdadero. Revertientes de segundo sitio: la mutación se produce en un sitio diferente en el DNA. Pueden causar restauración de un fenotipo salvaje si funcionan como mutaciones supresoras (mutaciones que compensan el efecto de la mutación original y restablecen el fenotipo original) 1- una mutación en algún lugar del mismo gen que restaura la función enzimática. 2- una mutación en otro gen que restablezca la función original del gen mutado 3- una mutación en otro gen cuyo resultado es la producción de una enzima que sustituya la enzima mutada. 22

23 Las mutaciones pueden ser inducidas por agentes químicos, físicos o biológicos. Tautomería de las bases: mutaciones espontáneas Citosina y timina presentan tautómeros (poco frecuentes) El patrón de puentes de hidrógenos de los tautómeros genera apareamiento C-A y T-G introduciendo errores en la replicación 23

24 Qué ocurre cuando estas formas tautoméricas son incorporadas al ADN en la etapa de replicación? Agentes físicos: radiaciones Radiaciones ionizantes: rayos X y Producen ionización del agua: radicales libres OH. que reaccionan con macromoléculas; DNA, produciendo lesiones 24

25 Radiaciones no ionizantes: UV Radiaciones no ionizantes ó ultravioleta: Las bases del DNA absorben fuertemente a 260 nm. Formación de dímeros de pirimidina (T-T): se unen covalentemente entre si en la misma cadena de DNA, Deformación de la hélice del ADN lo que impide el paso o aumenta la probabilidad de lectura errónea por la DNA polimerasa. Reconocimiento por sistema reparador La reparación es susceptible de cometer errores Test de Ames: para detectar químicos mutágenos y carcinógenos La cepa de Salmonella His - (cepa auxótrofa) no crece en el medio mínimo sin histidina, aunque aparecen algunas colonias revertientes naturales. El carcinógeno en el medio inducirá una retromutación ó reversión a His + haciendo que haya más colonias que pueden crecer en este medio. 25