EVALUACIÓN DE CÉLULAS NKT DE CADENA INVARIANTE

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1 XIX National Congress of Biochemical Engineering VIII International Congress of Biochemical Engineering XII Biomedicine and Molecular Biotechnology Scientific Meetings Clave: BMD78CAR EVALUACIÓN DE CÉLULAS NKT DE CADENA INVARIANTE Y DE CÉLULAS DENDRÍTICAS PLASMACITOIDES EN EL MODELO DE LUPUS EN RATÓN INDUCIDO POR PARTÍCULAS LIPÍDICAS Carla Landa Saldívar; Albany Reséndiz Mora; Mirella Ortiz Vértiz; Carlos Wong Ramírez; Leopoldo Flores Romo*; Isabel Baeza Ramírez & Carlos Wong Baeza*. DIRECCIÓN DE LOS AUTORES Departamento de Bioquímica, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (IPN). Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n. c.p D.F. México. * Departamento de Biología Celular, CINVESTAV. Av. Instituto Politécnico Nacional c.p D.F. México. CORREO ELECTRÓNICO carla_tao@hotmail.com

2 INTRODUCCIÓN El modelo de lupus en ratón desarrollado por nuestro grupo de trabajo, se genera por la estabilización de lípidos asociados en partículas lipídicas en membranas celulares y liposomales. Estas partículas son asociaciones lipídicas distintas a la bicapa y son transitorias, pero al ser estabilizadas por fármacos como cloropromacina, promacina e hidralazina son reconocidas por el sistema inmunológico e inducen la formación de anticuerpos anti-partículas lipídicas. También se demostró que parte de estos anticuerpos anti-partículas lipídicas son de clase IgG (1), lo que es importante porque está clase de anticuerpos son los causantes de autoinmunidad (2). La producción de anticuerpos clase IgG implica la participación de órganos linfoides secundarios como los ganglios linfáticos y bazo. Los cuales proveen el micro ambiente necesario para que se lleve a cabo la interacción de las células del sistema inmunológico con el antígeno y de las células del sistema inmunológico entre sí (2,3). Dentro de los centros germinales presentes en estos órganos, los linfocitos B presentan antígenos lipídicos a células NKT de cadena invariante (inkt) por medio de moléculas CD1d. Después la célula inkt induce en el linfocito B un proceso de hipermutación somática y el cambio de isotipo que lleva a la producción de anticuerpos de clase IgG contra lípidos (3). Por otro lado, los pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) presentan altas concentraciones de interferón tipo I en suero, las células dendríticas plasmacitoides (pdcs) son las principales productoras de esta citocina, y en los pacientes con LES estas células están aumentadas en los órganos linfoides secundarios (2,4). Al igual que los pacientes, los ratones con lupus presentan altas concentraciones de interferón tipo I. OBJETIVOS Estudiar la presencia, variación y distribución en órganos linfoides secundarios de las células inkt y de pdc en los ratones del modelo.

3 MATERIALES, MÉTODOS Y DESARROLLO Los antígenos liposomales (partículas lipídicas) se prepararon al incubar con el fármaco promacina, los liposomas unilamelares de fosfatidilcolina: fosfatidato en porción 2:1. La formación de estos antígenos se determinó por citometría en el citómetro LSR Fortessa (Becton Dikinson). Para realizar el estudio, se emplearon 4 grupos de 6 ratones hembra 2 grupos de BALB/c y 2 de C57BL/6. A los primeros de cada cepa se les administraron liposomas sin partículas lipídicas y a los segundos liposomas con partículas lipídicas inducidas con promacina. Los grupos recibieron las suspensiones una vez por vía intraesplénica y dos veces por vía intradérmica. Los sueros se separaron y se analizaron por ELISA liposomal. Los resultados se expresaron en unidades arbitrarias y se analizaron con el programa GraphPad Prism 5.0, se tomaron como positivos los sueros que presentaron títulos estadísticamente significativos (P 0.01) de anticuerpos clase IgG anti-partículas lipídicas. Los grupos que recibieron liposomas con partículas lipídicas presentaron títulos estadísticamente significativos de anticuerpos clase IgG mientras que los que recibieron liposomas lisos no. Un día después del segundo sangrado, los ratones se sacrificaron y se extrajeron los bazos y ganglios linfáticos inguinales. Los órganos se dividieron y se colocaron en solución de FACS para los estudios de citofluorometría y en Tissue-Tek para los de inmunofluorescencia. La citofluorometría se realizó inmediatamente después de la extracción. Se realizaron de manera independiente las tinciones citofluorométricas para identificar los antígenos CD11c, B220 y Gr-1 en células dendríticas plasmacitoides y NK 1.1 y CD3 en células inkt. Las tinciones se leyeron en el citómetro LSR Fortessa y los resultados se analizaron con el programa FlowJo (TreeStar). RESULTADOS El análisis de las células inkt por citofluorometría de los ratones BALB/c y C57BL/6, tanto del grupo control como de los que desarrollaron la enfermedad al administrar lípidos en partículas lipídicas

4 inducidas por promacina, se realizó mediante un doble marcaje al utilizar los anticuerpos anti-cd3 y anti- NK 1.1, unidos a FITC o APC, respectivamente. En el cuadrante superior derecho de la Figura 1 se presenta la población de células inkt de ratones C57BL/6 que desarrollaron la enfermedad comparado con el grupo control (Figura 1), el cual muestra un incremento en el número de células inkt en el bazo y ganglios inguinales de estos ratones. Se hizo el mismo estudio para analizar las células inkt en los bazos y ganglios inguinales de los ratones BALB/c, observándose un claro aumento en el número de estas células en los ratones que desarrollaron la enfermedad (los datos no se muestran). De la misma manera se realizó el análisis de las células dendríticas plasmacitoides de ambas cepas de ratón, tanto del grupo control como de los que desarrollaron la enfermedad al administrar lípidos en partículas lipídicas inducidas por promacina, empleándose un triple marcaje al utilizar los anticuerpos anti- B220, anti-cd11c y anti-gr-1, unidos a FITC, APC o PercP, respectivamente. Posteriormente, se llevó a cabo la selección de la región de leucocitos en base a su tamaño y granularidad para ambas cepas y de estas células se seleccionaron las que tienen el doble marcaje de B220 y CD11c, para después identificar a las células que además tienen el marcador Gr-1 que son las que representan el triple marcaje e identifican a las células dendríticas plasmacitoides. Este procedimiento se llevó a cabo tanto en el bazo como en los ganglios inguinales de los ratones BALB/c y C57BL/6. Los resultados obtenidos del análisis de bazo de ratones BALB/c se presentan en la Figura 2, en donde además se comparan los resultados de los ratones control y de los ratones enfermos.

5 Figura 1. Células inkt de bazo y ganglios inguinales de ratones C57BL/6. Se emplearon ratones administrados con liposomas: (A y C) sin partículas lipídicas, (B y D) con partículas lipídicas inducidas con promacina. En todas las gráficas se observan en los cuadrantes superior derecho las células doble positivas para los marcadores NK 1.1 y CD3 que representan a las células inkt, en dónde (A y B) son de bazo y (C y D) son de ganglios inguinales. Figura2. Células dendríticas plasmacitoides de bazo de ratones BALB/c. Se emplearon ratones administrados con liposomas: (A y B) sin partículas lipídicas, (C y D) con partículas lipídicas inducidas con promacina. En A y C se observan las células doble

6 positivas para los marcadores B220 y CD-11c; en B y D se encuentran las células positivas para el marcador Gr-1. DISCUSIÓN Con el incremento de pdcs e inkt en los ratones enfermos comparado con los ratones control, se puede proponer que dichas células participan en el desarrollo de lupus en ratones y posiblemente en los pacientes con lupus; sin embargo, es necesario hacer estudios para determinar si las células inkt son antígeno específicas para partículas lipídicas. CONCLUSIONES 1) La enfermedad autoinmune desarrollada en ratones C57BL/6 fue similar al modelo en ratones BALB/c. 2) Se obtuvieron títulos de anticuerpos anti-partículas lipídicas clase IgG estadísticamente significativos en ambos modelos de lupus en ratón. 3) Se encontró un aumento de células inkt y pdcs en órganos linfoides secundarios de ratones enfermos. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Wong-Baeza, C., et al. (2012). Molecular organization of the nonbilayer phospolipid arrangements that induce an autoimmune disease resembling human lupus in mice. Mol Membr Biol. 9 (2): Murphy, K., et al. (2011). Janeway s Immuno Biology 8 th ed. Garland Pub. Inc. New York and London Vinuesa, C.G. & Ping, C.P. (2013). Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14: Wahren-Herlenius, M. & Dorner, T. (2013) Immunopathogenic mechanisms of systemic autoimmune disease. Autoimmune Rheumatic Diseases. 3(382): REFERENCIAS INFORMÁTICAS