INTERES CLINICO EL UMELISA TSH ha sido concebido para el pesquisaje de Hipotiroidismo Congénito en recién nacidos. Esta enfermedad, causada por la
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- Magdalena Montes Calderón
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1 1 INTERES CLINICO EL UMELISA TSH ha sido concebido para el pesquisaje de Hipotiroidismo Congénito en recién nacidos. Esta enfermedad, causada por la ausencia anatómica o funcional de la glándula Tiroides, constituye la causa más frecuente de retraso mental evitable, con una frecuencia aproximada a nivel mundial de 1:4 000 recién nacidos (1). El desarrollo del Hipotiroidismo Congénito puede evitarse sólo si el tratamiento sustitutivo comienza en los primeros momentos de la vida, por lo cual el diagnóstico precoz constituye la clave para el tratamiento exitoso de la enfermedad. En 1974 se desarrolló el primer programa de pesquisaje en recién nacidos en busca de Hipotiroidismo Congénito (2), basándose en la determinación de Tiroxina (T4). Teniendo en cuenta que el déficit de hormonas tiroideas condiciona un aumento en la secreción de la Hormona Estimulante del Tiroides (TSH) en sangre, se desarrolló un programa con objetivos similares, pero basado en la determinación de esta última hormona (3). Trabajos posteriores favorecen la utilización de la determinación de TSH sobre la determinación de T4 en el diagnóstico precoz de Hipotiroidismo Congénito (4,5). Esta determinación posibilita además la confirmación del diagnóstico de Hipotiroidismo Primario y elimina los resultados falsos positivos del pesquisaje cuando se utiliza T4 como primera determinación. En Cuba comenzó en 1986 un Programa Nacional de Pesquisaje de Hipotiroidismo Congénito en recién nacidos, basado en la determinación de TSH en suero de cordón mediante el ensayo UMELISA TSH (6,7). En recién nacidos pesquisados, desde el año 1986 hasta el 2007 se han encontrado 743 casos, para una frecuencia global de 1: La evaluación neuropsíquica de los niños bajo tratamiento muestra un desarrollo normal (8-10). El UMELISA TSH es un ensayo diseñado para el pesquisaje neonatal de Hipotiroidismo Congénito (HC) en muestras de suero de cordón umbilical, y para la confirmación y seguimiento de los pacientes con diagnóstico de la enfermedad, en muestras de suero humano. Debe ser utilizado con el Sistema Ultramicroanalítico (SUMA), adecuado para efectuar la prueba en óptimas condiciones y garantizando el empleo del equipamiento necesario. FUNDAMENTO DEL ENSAYO La Hormona Estimulante del Tiroides (TSH) es una hormona glicoproteica con un peso molecular de D. Está compuesta de dos cadenas polipeptídicas que se han denominado Alfa y Beta. La cadena Alfa muestra una gran similitud con las cadenas de las otras hormonas hipofisiarias de estructura similar (FSH, LH y HCG), mientras que la cadena Beta confiere a la hormona su especificidad inmunológica y funcional.
2 2 El UMELISA TSH es un ensayo heterogéneo inmunoenzimático tipo sandwich, en el cual se utiliza como fase sólida, placas de tiras con pocillos revestidos previamente con anticuerpos monoclonales anti-cadena Beta de la TSH, lo cual garantiza la especificidad del ensayo. Las muestras se incuban en los pocillos de las tiras de reacción, fijándose la TSH presente en las mismas a los anticuerpos que revisten las tiras. La realización de un lavado posterior elimina los componentes no fijados, permaneciendo en el pocillo el complejo anticuerpo- TSH. Se añade un conjugado anti-αtsh Humana (carnero)/fosfatasa Alcalina (F.A), el cual se unirá a la TSH fijada en la reacción anterior. Un nuevo lavado de las tiras elimina el conjugado en exceso. Al añadir un sustrato fluorigénico (4-Metilumbeliferil fosfato) en los pocillos de las tiras, éste resultará hidrolizado por la enzima del conjugado y la intensidad de la fluorescencia emitida será proporcional a la concentración de TSH presente en la muestra. CONTENIDO DEL ESTUCHE Y PREPARACION DE LAS SOLUCIONES DE TRABAJO Código UM 2004 (288 pruebas) y Código UM 2104 (480 pruebas) UM 2004 UM 2104 Contenido: Placa recubierta de 12 tiras x 8 pocillos 3 5 R1: Solución Tampón 2 x 25 ml 2 x 25 ml R2: Suero de Carnero 1 x 18 ml 1 x 18 ml R3: Suero Estándar (a - f)* 6 x Liofilizado 6 x Liofilizado R4: Suero Control 1 x Liofilizado 1 x Liofilizado R5: Conjugado 1 x 7,5 ml 1 x 7,5 ml R6: Sustrato 1 x 2 ml 1 x 2 ml R7: Tampón Sustrato 1 x 18 ml 1 x 18 ml El lote de las placas recubiertas se muestra en el borde de su envase primario, el cual está compuesto por cinco dígitos, los cuatro primeros representan la fecha de vencimiento de las placas y el quinto representa un indicador numérico interno del proceso de producción. Todos los reactivos contienen azida sódica como agente preservante. Los Sueros Estándares y el Suero Control fueron negativos a las pruebas de detección de anti-vih 1+2, HBsAg, Anti-VHC y Sífilis, no obstante deben ser manipulados como materiales potencialmente infecciosos.
3 3 Preparación de las soluciones de trabajo: R1: Para 4 tiras de reacción, diluya 2 ml de la solución R1 hasta un volumen de 50 ml con agua destilada. Mezcle suavemente para evitar la formación excesiva de espuma. Prepare sólo lo necesario para el ensayo. R2: Diluya 1:4 con solución de trabajo R1. Volumen necesario para 4 tiras de reacción: 4 ml (1 ml de R2 + 3 ml de R1). R3: Reconstituya cada frasco con 0,5 ml de la solución de trabajo R2. Permita su completa disolución y mezcle. R4: Reconstituya con 0,5 ml de la solución de trabajo R2. Permita su completa disolución y mezcle. R5: Listo para el uso. Volumen necesario para 4 tiras: 0,8 ml. R6: Diluya 1:10 con R7. Volumen necesario para 4 tiras de reacción: 2 ml (0,2 ml de R6 + 1,8 ml de R7). Prepare inmediatamente antes de usar. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Todos los reactivos deben mantenerse entre de 2 a 8 C. En estas condiciones, serán estables en el envase original hasta la fecha de vencimiento. Después de utilizar parte del contenido de los reactivos, el resto es estable durante dos meses si se mantienen las mismas condiciones de almacenamiento y se evita la contaminación durante la ejecución de la prueba. Las tiras de reacción no utilizadas se mantienen estables durante dos meses entre 2 y 8 C en la bolsa suministrada, protegida con el desecante y herméticamente cerrada. MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS - Agua destilada. - Pipeta multicanal con puntas desechables para 10 µl. - Pipetas de precisión entre 10 y µl. - Probetas graduadas entre 10 y 250 ml. - Incubadora de 37 ± 1 C. - Papel absorbente.
4 4 PRECAUCIONES - Manipule las muestras, los Sueros Estándares y el Suero Control como potencialmente infecciosos. Utilice guantes desechables. Los materiales utilizados deben colocarse en soluciones desinfectantes (Hipoclorito de sodio al 5 %) o esterilizarse en autoclave. - Considere a los equipos y accesorios que se han puesto en contacto directo con las muestras y reactivos como contaminados. Realice los procedimientos de limpieza indicados en los manuales de usuario correspondientes. - Antes de comenzar a trabajar, verifique que todos los reactivos estén a la temperatura del laboratorio y los Sueros Estándares y el Suero Control, una vez preparados según las especificaciones se encuentren completamente disueltos. - Las tiras de reacción deben estar a la temperatura del laboratorio antes de retirarles la cubierta protectora, para evitar que se condense humedad en su superficie. - Verifique que las tiras de reacción estén niveladas en el soporte. - Utilice puntas limpias o nuevas para la reconstitución y el trabajo con las soluciones y las muestras. - Los sueros a utilizar deben ser preferentemente frescos, sin precipitados y debe evitarse la congelación y descongelación reiterada de los mismos. Las muestras pueden almacenarse durante 5 días a una temperatura entre 2-8 ºC. Para conservarse durante períodos de tiempo más largos, se recomienda almacenar adecuadamente a -20 ºC. - Garantice el adecuado control de la humedad en todos los pasos de la prueba. Las muestras y reactivos una vez aplicados, deben mantenerse en las cámaras húmedas para evitar su evaporación ya que esto puede alterar los resultados. - Verifique periódicamente la exactitud y precisión de las pipetas. - Cumpla las normas de manipulación de los equipos utilizados y verifique previamente su adecuado funcionamiento, tenga especial cuidado en las operaciones de pipeteo y lavado. - Si utiliza la multipipeta ERIZO para transferir los Sueros Estándares, el Suero Control y las muestras, debe lavar profusamente sus puntas para evitar la contaminación, al menos un lavado de cinco ciclos con solución de trabajo R1 y un lavado de cinco ciclos con agua destilada. Deseche la solución y el agua destilada después de cada lavado. - No incorpore a los frascos originales remanentes de reactivos - Evite posibles contaminaciones con materiales fluorescentes. - Evite la exposición a la luz de los frascos que contienen el sustrato.
5 5 - El juego de reactivos no debe emplearse después de la fecha de vencimiento. - Los reactivos del UMELISA TSH de lotes diferentes no se deben intercambiar. PROCEDIMIENTO TECNICO 1.- Preparación de los Sueros Estándares, el Suero Control y las muestras. Sueros Estándares y Suero Control: Los Sueros Estándares y el Suero Control, una vez reconstituidos quedan listos para su uso. La concentración de los Sueros Estándares corresponde a la especificada en la etiqueta de los frascos. Muestras: Diluya los muestras 1:2 con la solución de trabajo R2, al menos 15 minutos antes de transferirlos a las tiras de reacción. 2.- Adición de los Sueros Estándares, el Suero Control y las muestras a las tiras de reacción. Añada 10 µl de los Sueros Estándares, el Suero Control y las muestras, según el siguiente esquema de distribución: A R3a R3e B R3a R3e C R3b R3f D R3b R3f E R3c R F R3c R G R3d H R3d Los Sueros Estándares (R3a - R3f) y el Suero Control (R4) deben añadirse de forma manual con una pipeta de precisión. Se recomienda evaluar las muestras por duplicado. Si utiliza el programa UMELISA TSH para la interpretación automática de los resultados, debe colocar en las posiciones 1 y 2 la primera muestra, en las posiciones 3 y 4 la segunda y así sucesivamente.
6 6 3.-Incubación de los Sueros Estándares, el Suero Control y las muestras. Incube las tiras de reacción durante 2 horas a 37 C en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura. 4.-Lavado. Utilice un lavador de la tecnología SUMA. Lave las tiras de reacción 4 veces. Verifique el llenado total del pocillo con la solución R1 de trabajo (25 µl). La solución debe permanecer como mínimo 30 segundos en los pocillos en cada lavado. Después de la última aspiración seque las tiras sobre papel absorbente. 5.- Adición del conjugado. Con una punta nueva extraiga del frasco de conjugado el volumen necesario según el número de tiras del ensayo y deposítelo en un recipiente limpio. Añada 10 µl del conjugado en cada pocillo de reacción. 6.- Incubación del conjugado. Incube las tiras de reacción 1 hora a 37 C en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura. 7.- Lavado. Lave las tiras de reacción según se describe en el acápite Adición del sustrato. Coloque 10 µl de sustrato convenientemente diluido en cada pocillo de las tiras de reacción. 9.-Incubación del sustrato. Incube en cámara húmeda a una temperatura entre C. Normalmente se requiere una incubación de 30 minutos para alcanzar una señal fluorescente de 120 a 160 unidades para el Suero Estándar R3f, sin embargo, debido a las variaciones de temperatura puede resultar conveniente que cada laboratorio ajuste el tiempo de incubación para lograr estos niveles de fluorescencia. 10.-Lectura. Realice la lectura de la intensidad de la fluorescencia emitida en cada determinación utilizando un lector de la serie SUMA.
7 7 PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO -Los valores de fluorescencia de las muestras de concentración desconocida se interpolan en un gráfico de fluorescencia contra el logaritmo de la concentración de TSH correspondiente a la Curva Estándar, obteniéndose los valores de concentración en mui/l. Entre el Suero Estándar R3a y el R3b se utiliza una escala lineal-lineal. Este procedimiento es realizado automáticamente por el lector SUMA. Curva Estándar Fluorescencia TSH (mui/l) -La validación, interpretación e impresión de los resultados son realizados automáticamente por el programa UMELISA TSH. Si no dispone del mismo los resultados obtenidos se determinan comparando los valores de concentración de TSH calculada con el valor de referencia. CONTROL DE LA CALIDAD I. La Curva Estándar debe cumplir la siguiente condición: La media de los dos valores de fluorescencia para cada Suero Estándar (R3a - R3f) deben proporcionar un incremento en fluorescencia proporcional a su concentración, siguiendo un patrón similar al ejemplificado, los valores discordantes son eliminados automáticamente por el programa.
8 8 II. El valor de concentración calculado para el Suero Control debe encontrarse en el intervalo establecido para el ensayo. III. Si las muestras son analizadas por duplicado deben cumplir la siguiente condición: La diferencia de los valores de fluorescencia de los duplicados de una muestra debe ser menor al 10 % con respecto a su valor medio. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Teniendo en cuenta los diferentes factores genéticos y ambientales que actúan sobre poblaciones de diferentes localizaciones geográficas, la práctica internacional recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. En el Programa Cubano de Pesquisaje de Hipotiroidismo Congénito, los sueros que presentan en la primera determinación una concentración de TSH superior a 30 mui/l, son considerados como elevados. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DEL ENSAYO 1. PRECISIÓN. Se evaluaron tres muestras de concentraciones conocidas de TSH en el ensayo (intraensayo) y el mismo fue repetido durante varios días (interensayo). Precisión del UMELISA TSH (mui/l) Intraensayo Interensayo (n= 20) (n= 20) DE CV (%) DE CV (%) 15,1 0,8 5,3 1,2 7,95 35,2 1,4 3,98 2,3 6,53 80,4 2,6 3,23 4,2 5,22 DE: Desviación Estándar CV: Coeficiente de Variación
9 9 2. EXACTITUD. El porcentaje de recuperación obtenido, al añadir diferentes cantidades de TSH a cinco muestras de suero con diferentes niveles de concentración de TSH promedió un 100,65 % ± 2,45. Recuperación del UMELISA TSH Muestras (mu/l) mui/l TSH añadida Valor Esperado (mui/l) Valor Obtenido (mui/l) Recuperación (%) 1 8, ,54 19,09 102, , ,63 39,85 98, , ,38 87,16 100,90 Se realizaron diluciones seriadas a cuatro muestras de pacientes con altos niveles de TSH, mostrándose paralelas a la Curva Estándar Las concentraciones calculadas, después de corregir el factor de dilución para cada muestra y el control mostraron curvas paralelas al eje de las abscisas. Paralelismo del UMELISA TSH
10 10 3. LÍMITE DE DETECCIÓN (DETECTABILIDAD) Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN. La concentración mínima detectable en el UMELISA TSH fue de 0,3 mui/l. Se definió como la menor cantidad de TSH presente en una muestra que puede ser detectada con una probabilidad del 95 %, utilizando como referencia el patrón internacional IRP de la OMS. El límite de cuantificación calculada para el UMELISA TSH fue de 0,6 mui/l y se definió como la menor cantidad de TSH presente en una muestra que puede ser cuantificada con una precisión y exactitud inferior al 20 %. 4. INTERVALO DE MEDICIÓN DEL ENSAYO. El UMELISA TSH es confiable, preciso y exacto en el rango de 0,6 mui/l a 96 mui/l. 5. ESPECIFICIDAD. Se evaluó la reactividad cruzada con otras hormonas glicoproteícas. FSH (-) LH (-) HCG (-) No se ha evidenciado interferencia en el ensayo con otras proteínas séricas. 6. EFECTO HOOK. No se mostró evidencia de efecto Hook a concentraciones de TSH de 100 UI/L.
11 11 BIBLIOGRAFÍA 1.-Dussault, J.H.; Walker, P.: In Congenital Hypothyroidism. Ed. Marcel Dekker, INC. New York, Dussault, J.H. et al.: Preliminary report on a mass screening program for neonatal hypothyroidism. J Pediat. 86:670, Irie, M.; Enomoto, K.; Naruse, H.: Measurement of thyroid stimulating hormone in dried blood spot. Lancet 2: 1233, Naruse, H. et al: The result of parallel assay of TSH and T4 in the same sample. In Naruse H.; Irie, M. (Eds): "Neonatal Screening". Amsterdam: Excerpta Medica. pag. 69, Fukusi, M. et al.: Screening survey for congenital hypothyroidism by measuring of TSH and T4. En Naruse, H.; Irie, M. (Eds): "Neonatal Screening". Amsterdam. Excerpta Medica, pag. 71, Robaina, R et al.: Tsh Ultramicroelisa for mass screening program of Congenital Hypothyroidism. En Progress in Pediatric. Endocrinology. Pág 113. Friedrich Schiller Universitat. Jena, Guell R, et al.: Informe preliminar sobre el Programa para la detección Precoz de Hipotiroidismo Congénito. Rev Cub Ped. 61: 849, Guell, R et al.: National Screening Program for Neonatal Hypo-thyroidism. En International Screening Symposium of Inborn Errors of Metabolism. Libro de Resúmenes. Sao Paolo. Brasil. Nov Guell R, et al.: Programa Nacional de Detección Precoz de Hipo-tiroidismo Congénito. Cuba, Rev. Cub. Endocrinol.1:61, Alvarez, M.A et al.: Evaluación neuropsíquica de niños diagnosticados en el Programa Nacional de Detección Precoz de Hipotiroidismo Congénito. Rev. Cub. Endocrinol. 1:68, Edición No. 3 Enero 7, 2015 UMELISA TSH Códigos UM 2004 y UM Centro de InmunoEnsayo. Calle 134 y Ave. 25, Apdo. Postal 6653, La Habana, Cuba. Teléfono: , Fax (537)
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