PCR A TIEMPO REAL. María Maiques R4-Bioquímica Clínica 25-Abril-07

Transcripción

1 PCR A TIEMPO REAL María Maiques R4-Bioquímica Clínica 25-Abril-07

2 VEAMOS Herramientas para detectar mutaciones Moléculas fluorescentes y tecnología FRET PCR a tiempo real: equipos y métodos de detección Interpretación de resultados Utilidades de PCR a tiempo real Ventajas y aplicaciones Conclusiones

3 SYBRGreen Secuenciación SONDAS ESPECÍFICAS Hibridación

4 COMPONENTES DE LA REACCIÓN SYBRGreen SONDAS ESPECÍFICAS

5 FLUORESCENCIA *FLUORESCENCIA E Estado de Máxima Excitación Estados Intermedios CALOR Tiempo Estado Fundamental E = h/λ

6 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) FRET es un proceso por el cual un fluoróforo (DONADOR) en estado excitado, transfiere su energía a una molécula próxima (ACEPTOR) E1= h/λ1 E3= h/λ3 E1 > E2 > E3 λ1 < λ2 < λ3 E2= h/λ2 FRET se produce sólo si las dos moléculas (DONADOR Y ACEPTOR) están suficientemente juntas, disminuyendo su eficacia al aumentar la distancia entre ellas

7 MÉTODOS DETECCIÓN: sybr-green SYBR Green I Unión inespecífica al DNAds ELONGACIÓN Requiere empleo curvas de melting Emite señal intensa que aumenta proporcionalmente al producto acumulado

8 ANÁLISIS DE RESULTADOS Umbral de detección Ct: primer ciclo de la PCR en el que se detecta producto amplificado Ct es inversamente proporcional a la cantidad de DNA o RNA de partida

9 SYBRGreen Secuenciación SONDAS ESPECÍFICAS Hibridación

10 COMPONENTES DE LA REACCIÓN Sondas específicas

11 MÉTODOS DETECCIÓN: sondas FRET Fluorescein LC Red Hibridación de sondas específicas, marcadas con ANNEALING 2 fluorocromos (donador y aceptor) Su aproximación disminuye la fluorescencia emitida x el donador (FRET)

12 MÉTODOS DETECCIÓN: sondas de hidrólisis (TAQMAN ) Sondas específicas con un fluorocromo en cada extremo (Reporter y Quencher) Apantallamiento cuando la sonda está intacta ELONGACIÓN

13 INSTRUMENTACIÓN

14 ANÁLISIS DE RESULTADOS Umbral de detección Ct: primer ciclo de la PCR en el que se detecta producto amplificado Ct es inversamente proporcional a la cantidad de DNA o RNA de partida

15 SYBRGreen Secuenciación SONDAS ESPECÍFICAS Hibridación

16 DISCRIMINACIÓN ALÉLICA Alelo normal o wild-type Alelo mutante

17 DISCRIMINACIÓN ALÉLICA WILD-TYPE HETEROCIGOTO HOMOCIGOTO

18 UTILIDADES DE LA PCRtr Detección de mutaciones, discriminación alélica Cuantificación - absoluta (patrón de diluciones estándar) -relativa(respecto a un control) Caracterización de productos de PCR

19 UTILIDADES DE LA PCRtr Detección de mutaciones, discriminación alélica Cuantificación GENES DE REFERENCIA - absoluta (patrón de diluciones estándar) -relativa(respecto a un control) Caracterización de productos de PCR

20 UTILIDADES DE LA PCRtr Gene Genomic structure / pseudogenes Regulation e.g. ß-actin multigene family; > 20 genes; 1 active locus : hormones of tyroid gland 20 pseudogenes : stomach tumor γ-actin multigene family; pseudogenes GAPDH multigene family; genes; > 200 in mouse : lung, pancreatic, colon cancer mostly pseudogenes : insulin, EGF 5.8S,18S, 28S RNA pseudogenes ß2-microglobulin no pseudogenes : Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors G6PDH no pseudogenes : kidney, stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factors Detección de mutaciones, discriminación alélica PBGD no pseudogenes aldolase pseudogenes HPRT pseudogenes U3, U8,... Pseudogenes ornithin decarboxylase... GENES HOUSEKEEPING : tumors

21 Cuantificación absoluta

22 UTILIDADES DE LA PCRtr Detección de mutaciones, discriminación alélica Cuantificación - absoluta (patrón de diluciones estándar) -relativa(respecto a un control) Caracterización de productos de PCR

23 Cuantificación relativa Gen Referencia Gen Diana y = -1,0365x + 28,82 R 2 = 0,9936 Log ng RNA Ct y = -0,7147x + 27,213 R 2 = 0,9852 Log ng RNA Ct MUESTRAS Ct GD Ct GR ng GD ng GR GD/GR Ratio Cerebro * Músculo * Hígado * Riñón *

24 UTILIDADES DE LA PCRtr Detección de mutaciones, discriminación alélica Cuantificación - absoluta (patrón de diluciones estándar) -relativa(respecto a un control) Caracterización de productos de PCR

25 Caracterización de productos de PCR Cada producto de PCR se caracteriza por su T m (Tª a la que el 50% del DNA está en forma de cadena sencilla) Diferentes DNA tienen distintas T m y productos Amplificación no específicos como dímeros DNA-primers también. Detección con SYBRGREEN La T m varía con: GC 41 C GC 50 pb 10 C 10,000 pb La T m depende de: Identificación Concentración del producto de sales, MgCl 2, Sybr-green Grado de homología entre la sonda y el DNA

26 VENTAJAS DE LA PCRrt Amplificación específica Automatización y disminución del tiempo de análisis Reacción monitorizada a tiempo real No procesamiento post-pcr: no contaminación Ciclos de amplificación rápidos (<2h) Detección de cambios en la señal <2x Más específico, sensible y reproducible Coste similar a PCR convencional

27 APLICACIONES DE LA PCRrt Determinación agentes patógenos Expresión génica en tejido en diferentes estadios de la enfermedad o tras tratamiento Deleción o amplificación de genes Discriminación alélica Diagnóstico clínico de tumores o respuesta a tto Genotipado, detección de SNPs, haplotipo Validación de resultados de experimentos con arrays Metilación de DNA y estudio de apoptosis Monitorización de patrones de expresión de citoquinas

28 CONCLUYENDO La baja probabilidad de contaminación, la exactitud de los resultados y la sencillez, rapidez y automatización del método, hacen de la PCRrt una técnica cada vez más utilizada en todos los laboratorios

29 MUCHAS GRACIAS!