SERVICIOS LABORATORIO HISTOCOMPATIBILIDAD

Transcripción

1 SERVICIOS LABORATORIO HISTOCOMPATIBILIDAD El laboratorio de histocompatibilidad está capacitado para desarrollar los estudios necesarios para trasplantes de órganos de acuerdo a los requerimientos internacionalmente establecidos. La importancia del laboratorio en los programa de órganos sólidos y tejidos es realizar el estudio de histocompatibilidad de receptores y donante vivos y cadáver según los requerimientos propios de cada tipo de trasplante. De esta forma dependiendo del órgano a trasplantar los estudios pueden ser de mayor o menor complejidad. La primera compatibilidad requerida entre donante y receptor es el grupo sanguíneo del sistema ABO en la mayoría de los trasplantes. El impacto de la compatibilidad HLA entre donante y receptor en la evolución del trasplante es variable según el órgano a trasplantar y con la situación inmunológica de cada paciente, siendo fundamental en trasplante de médula ósea. Es necesario evaluar la presencia de anticuerpos anti HLA preformados, presentes en el suero del receptor, en contra de los antígenos expresados en los linfocitos del donante, lo que se realiza por la prueba de reactividad cruzada o crossmatch. Esta prueba pretende evitar la perdida inmediata del injerto por rechazo inmunológico. Los servicios prestados por la Sección de histocompatibilidad se pueden agrupar en 4 categorías: 1.- ESTUDIOS DE DONANTE CADÁVER Y SELECCIÓN DE RECEPTORES: que por su condición, es considerado de urgencia, para esto el laboratorio realiza turnos diarios cuando se requieren. El estudio de donante cadáver considera la verificación del grupo sanguíneo ABO y la determinación de los antígenos HLA y esta información se ingresa al software de selección de receptores. 2.- EXÁMENES PARA TRASPLANTE: que son aquellos que se realizan a receptores y donantes de los programas donante vivo y cadáver. Se realizan la verificación del grupo sanguíneo ABO y determinación de antígenos HLA. Además se realiza la determinación de anticuerpos anti HLA en el receptor tanto específicos contra el donante como los no específicos. Los estudios de antígenos y anticuerpos realizados a los receptores se ingresan a la base de datos del programa de trasplante y esta información se utiliza en la selección de los receptores para trasplante con donante cadáver. 3.- DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS HLA ASOCIADO A ENFERMEDADES: en esta actividad el laboratorio realiza estudios solo para determinadas patologías. 4.- PEEC HLA-B27: El laboratorio realiza el programa de evaluación externa de calidad de los laboratorios clínicos nacionales, que ofrecen esta prestación en forma rutinaria. D los exámenes que el laboratorio realiza algunos son considerados de referencia como HLA asociado a enfermedades y exámenes pre trasplante que son programados diariamente y otros son aquellos estudios realizados a los donantes cadáveres donde el

2 análisis y la selección de los receptores requieren de urgencia. Se detalla a continuación la actividad realizada en cada uno de ellos. EXÁMENES DE URGENCIA: Son aquellos que se realizan para la selección y asignación de riñones de un donante cadáver y para ello se realizan turnos diurnos y nocturnos cuando es necesario. Las muestras para estos estudios son recibidas con una solicitud de examen y firmada por el médico procurador o por el médico coordinador de la Corporación del Trasplante. Los receptores a probar con un donante cadáver deben ser compatibles con el grupo sanguíneo del donante. A todos los donantes cadáver se le realiza la determinación de antígenos HLA la que se ingresa a un software específico que almacena la información de todos los receptores que están en lista de espera para un trasplante renal. El programa genera un listado priorizado con puntajes en base a criterios establecidos (Criterios de asignación). A los receptores con mayor puntaje se les realizan la prueba de reactividad cruzada o Crossmatch y aquellos cuyos resultados en esta prueba sean negativos pasan a una lista final respetando el puntaje previo. Se informa de esta selección a la Corporación de Trasplante y a los centros de trasplante. El laboratorio verifica que la distribución de los órganos se realice de acuerdo a la prorización entregada. EXÁMENES PARA TRASPLANTE: Los estudios de histocompatibilidad requeridos para los receptores de los diferentes órganos son solicitados con una interconsulta emitida por el médico tratante del centro de trasplante donde el receptor está siendo estudiado (cuya firma está registrada en el Laboratorio de histocompatibilidad). En esta interconsulta se solicita datos generales y clínicos del paciente y debe ser llenada completamente al ingreso a estudio, con la finalidad de tener en el laboratorio la completa identificación del paciente y conocer los antecedentes de transfusiones, embarazos y medicamentos administrados que pueden interferir en la identificación de los antígenos del sistema HLA o anticuerpos. Los estudios de histocompatibilidad de los receptores renales de las regiones IX al sur son realizados por el laboratorio de histocompatibilidad de Valdivia, que envía estos estudios al Instituto de Salud Pública para ser ingresados en la lista de espera nacional. Los exámenes que el laboratorio realiza para determinar el grado de compatibilidad entre los receptores y sus potenciales donantes son: 1.- Tipificación HLA 2.- Pruebas cruzadas (crossmatch) linfocitarias. 3.- Detección y monitoreo de anticuerpos anti HLA (PRA) 4.- Mantención de Seroteca Actualmente el laboratorio según el órgano a trasplantar realiza las siguientes pruebas : Organo Verificación Grupo ABO Tipificación HLA- ABDR Crossmatch Anticuerpos anti- HLA Riñón X X X X Corazón/Pulmón* X** X X Hígado X** Médula ósea X

3 *Para trasplante de corazón /pulmón se realiza crossmatch cuando el receptor tiene anticuerpos anti HLA positivo y lo solicita el médico tratante. **Realiza el centro de trasplante. 1-Tipificación de antígenos HLA (ABDR): Los antígenos HLA (Antígenos Leucocitarios Humanos) son identificados a partir del DNA obtenido de los leucocitos de los receptores y donantes. Las antígenos HLA presentes en las superficies de las células nucleadas, son las encargadas de que el sistema inmune diferencie lo propio de lo extraño e inducen una respuesta inmune de rechazo en el receptor de un trasplante, por tal motivo es importante buscar el donante mas compatible. Para estudiar los antígenos HLA este laboratorio utiliza la técnica de Biología molecular PCR-SSP (Sequence Specific Primers). Recepción de muestras, toma de muestras y resultados ver link Formularios. 2-Realización de pruebas cruzadas (Cross match) linfocitarias para trasplante de órganos sólidos Con el fin de evitar pérdida inmediata del injerto se realiza esta prueba que sirve para detectar en el suero de los receptores la presencia de anticuerpos dirigidos contra los antígenos HLA presentes en las células de su potencial donante. El resultado positivo de esta prueba es una contraindicación para realizar el trasplante mientras no se demuestre la ausencia de anticuerpos específicos para lo que se requiere otros análisis. Esta prueba cruzada detecta en el receptor anticuerpos a-hla preformados por transfusiones, transplantes previos o embarazos, contra los antígenos HLA presentes en linfocitos del donante. Hay distintos métodos, siendo c/u de ellos afectados por distintos factores, en nuestro laboratorio actualmente se realizan CDC/AHG (linfocitotoxicidad complemento dependiente) y FCXM (crossmatch por citometría de flujo). : a) Alo-crossmatch Linfocitos T y B (CDC/ AHG) El método de Citotoxicidad Dependiente de Complemento (CDC) con aumento de sensibilidad por uso de anti globulina humana (AHG), es considerada de menor sensibilidad que métodos de citometría de flujo, sin embargo es necesario realizarla por su correlación biológica. Este análisis es requisito previo para transplante renal y en ciertos casos se realiza en transplante cardiotoraxico. b) Alocrossmatch LT y LB por Citometria de Flujo (XMCF) Es un método de inmunofluorescencia indirecta, independiente de complemento, leído en Citómetro de Flujo con rayo láser. Sus mayores ventajas son: detecta bajas cantidades de anticuerpos preformados fijadores o no de complemento, tiene buena especificidad por usar linfocitos con tratamiento enzimático y marcaje con anticuerpos monoclonales, es más rápido que otros métodos y es más objetivo por ser leído por un equipo. Por su alta sensibilidad es indicado en pacientes de mayor riesgo de rechazo humoral o pérdida temprana de injerto, no siendo contraindicación absoluta de transplante, permitiendo junto a otros análisis estimar el riesgo de trasplante para un paciente determinado. Es usado tanto en el período pretransplante como post-transplante.

4 Recepción de muestras, toma de muestras y resultados ver anexos de Formularios. 3.-Detección y monitoreo de anticuerpos anti HLA en el suero de los receptores (PRA y Especificidad) El seguimiento y caracterización inmunológica de los pacientes en lista de espera para trasplante renal requiere la determinación en sangre de la presencia de anticuerpos dirigidos a los antigenos del complejo mayor de histocompatibilidad humano (HLA) a fin de evitar, en lo posible, la ocurrencia de rechazo del órgano trasplantado. Este seguimiento conlleva tanto la determinación del porcentaje de células frente a las que reacciona el suero (PRA) como la determinación de las especificidades HLA reconocidas por los anticuerpos presentes en el suero. La determinación de las especificidades HLA reconocidas por el suero nos permite preseleccionar en cada donación aquellos individuos que no presenten reactividad conocida frente a los antigenos HLA del donante. El laboratorio realiza estos estudios con 3 técnicas: a) Técnica de microlinfocitotoxicidad- CDC Consiste básicamente en una reacción antígeno-anticuerpo con fijación de complemento y visualización de la reacción con un colorante. Se utilizan células (linfocitos) aislados de sangre periférica. Mediante el uso de esta técnica determinamos la presencia de anticuerpos citotóxicos (fijadores de complemento: IgG e IgM) frente a antígenos HLA presentes en la superficie de los linfocitos. Para distinguir la presencia de anticuerpos relevantes en el trasplante (anti HLA) de anticuerpos no relevantes en el trasplante como autoanticuerpos de clase IgM se ha desarrollado un variante en la técnica que consiste tratar los sueros con dithiotreitol (DTT) para eliminar la IgM. La reacción se cuantifica según el porcentaje de lisis celular. Para la determinación del porcentaje de células que reacciona con el suero (PRA) se necesita ensayar cada suero con un panel celular linfocitario. b) Técnica de Elisa Esta técnica consiste en la detección de anticuerpos presentes en un suero que son capaces de reconocer antígenos HLA humanos purificados adheridos a un soporte sólido. La visualización de esta unión se realiza mediante el uso de un segundo anticuerpo marcado con una enzima y adición de un sustrato de la enzima que origina una reacción colorimétrica, cuya intensidad es proporcional al grado de reacción de estos anticuerpos y que luego es interpretada espectrofotometricamente. Se determina al ingreso de los receptores a programa de trasplante renal y permite en forma rápida identificar la presencia o ausencia de anticuerpos HLA. Si esta determinación es positiva se realiza la identificación de los anticuerpos anti HLA específicos. c) Técnica por Citometría de flujo: Es una metodología en fase sólida que utiliza antígenos HLA purificados y tiene una mayor sensibilidad que otras metodologías utilizadas en la determinación de los anticuerpos anti HLA. Permite determinar la presencia o ausencia de anticuerpos HLA y si esta reactividad es positiva se realiza el estudio de especificidad de los anticuerpos.

5 Por la complejidad y alto costo de esta metodología se aplica a situaciones de mediano y alto riesgo. d) Técnica de Fluorometria Luminex El Luminex es un analizador flexible basado en los principios de citometría de flujo y puede medir simultáneamente hasta 100 analitos. Utiliza esferas marcadas internamente con material fluorescente y a las que se le adhieren antigenos, lo que permite detectar anticuerpos. Esta técnica permite realizar un Nº mayor de determinaciones en un corto período de tiempo y permite también realizar Tipificación de antígenos. Recepción de muestras, toma de muestras y resultados ver link de Formularios. 4.-Mantención de Seroteca Los pacientes en programa de trasplante renal deben enviar todos los meses una muestra de suero que es almacenada en condiciones de temperatura controlada lo que constituye la seroteca. Estas muestras de seroteca son utilizadas para las pruebas cruzadas con los donantes cadáveres y en la determinación de anticuerpos anti HLA de los receptores que se realizan 2 veces al año. El Centro de trasplante coordina con los centros de diálisis el envío periódico de estas muestras de acuerdo a una calendarización entregada anualmente por la sección de histocompatibilidad a los centros de trasplante. Si la seroteca es descontinuada por más de 3 meses en pacientes sin anticuerpos HLA y por más de 45 días en pacientes con anticuerpos HLA, el paciente es inactivado de la lista de espera. Si esta situación persiste por mas de 1 año se retira de programa y a su reingreso se considera su tiempo de espera a partir de esa última fecha. Es importante el envío de seroteca de los receptores 15 días postranfusión o post infección de importancia clínica ya que se recomienda realizar determinación de anticuerpos posterior a estos eventos y estos sueros pueden enviarse fuera de la calendarización programada anualmente. El tiempo de almacenamiento de la seroteca es por un máximo de 2 años cada suero. Los sueros de pacientes trasplantados se mantienen por 3 meses post trasplante y se utilizan en reevaluaciones de anticuerpos cuando es necesario. La seroteca de los pacientes de los programas de trasplante no renal son estudiadas según la solicitud del médico tratante. Muestras de suero enviadas para estudios post rechazo deben indicar los tratamientos farmacológicos que está recibiendo el paciente.